މިހާރު *މިހާރުގެ އެޑްރެސް: ކޮލޯން 50931، ޖަރުމަނުވިލާތް، ކޮލޯން އެކްސެލެންސް ކްލަސްޓަރ ރިސާރޗް އޮން ސެލްއުލަރ ސްޓްރެސް ރެސްޕޮންސް އިން އެޖިންގ-ރިލެޓެޑް ޑިޒީޒްސް (ސީއީސީއޭޑީ) .
މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ބަލިތަކުގެ ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން ރިވަރސިބަލް ކަމަށް ބެލެވެނީ ނިއުރޯންތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ޕްލާސްޓިސިޓީ ލިމިޓް ވުމުން ނަމަވެސް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ އަސަރު ހަށިގަނޑުގައި ނިއުރޯނަލް މެޓަބޮލިޒަމްގެ ސެލް އޮޓޮނޮމީއަށް ކުރާކަން ރަނގަޅަށް ނޭނގެ އެވެ. މިތަނުގައި، އަޅުގަނޑުމެން ތަޢާރަފްކުރަނީ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފިއުޝަން ޑައިނަމިކްސް އަށް ބުރޫއެރުމުގެ ސަބަބުން ޕްރޮގްރެސިވް އޮކްސްފޯސް ޑެފިޝަންސީ ހުންނަ ޕަރކިންޖޭ ނިއުރޯންތަކުގެ ސެލް ސްޕެސިފިކް ޕްރޮޓީއޯމް އެވެ. އަހަރެމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ސަބަބުން ޕްރޮޓީއޮމިކްސްގެ ދާއިރާއަށް ފުން ބަދަލެއް އައިސް، އެންމެ ފަހުން ސެލް މަރުވުމުގެ ކުރިން ސީދާ މެޓަބޮލިކް ޕްރޮގްރާމްތައް ސިކުއެންޝަލް އެކްޓިވޭޓް ވެއެވެ. ހީވެސް ނުކުރާ ގޮތަކަށް އަޅުގަނޑުމެން ކަނޑައެޅީ ޓީސީއޭ ސައިކަލް އިންޓަރމީޑިއޭޓްސް ސަޕްލިމެންޓް ކުރުމާ ގުޅުންހުރި ޕައިރޫވޭޓް ކާބޮކްސިލޭޒް (ޕީސީއެކްސް) އާއި އެހެނިހެން ޕެރޮކްސިޑޭޒްތަކުގެ ފާޅުކަން ބޮޑު އިންޑަކްޝަން އެވެ. ޕީސީއެކްސް އިންހިބިޝަން ވުމުން އޮކްސިޑޭޓިވް ސްޓްރެސް އާއި ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން އިތުރަށް ގޯސްވެ، އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އަކީ އޮކްސްފޯސް ނެތް ނިއުރޯންތަކުގައި ރައްކާތެރިކަމުގެ އަސަރު ކުރާކަން ހާމަކޮށްދޭ ކަމެކެވެ. ޓާރމިނަލީ ޑިޖެނެރޭޓް ވެފައިވާ ނިއުރޯންތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފިއުޝަން އަލުން އާލާވުމުން މި މެޓަބޮލިކް ސިފަތައް މުޅިން ފުށުއަރާ، މިކަމުގެ ސަބަބުން ސެލް މަރުވުން ހުއްޓުވައެވެ. އަޅުގަނޑުމެންގެ ހޯދުންތަކުން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަނަށް ކެތްތެރިކަން ފޯރުކޮށްދޭ ކުރިން ނޭނގޭ މަގުތައް ދެނެގަނެ، ބަލީގެ ފަހު މަރުހަލާތަކުގައި ވެސް ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން ފަހަތަށް ޖެހިދާނެ ކަމަށް ދައްކަ އެވެ.
ނިއުރޯނަލް އެނާޖީ މެޓަބޮލިޒަމް ދެމެހެއްޓުމުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއާގެ މައިގަނޑު ދައުރަށް ބާރުއަޅަނީ އިންސާނާގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ބަލިތަކާ ގުޅިފައިވާ ފުޅާ ނިއުރޯލޮޖިކަލް އަލާމާތްތަކުންނެވެ. މި ބަލިތަކުގެ ތެރެއިން ގިނަ ބަލިތައް ޖެހެނީ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޖީން އެކްސްޕްރެޝަން (1، 2) ރެގިއުލޭޓް ކުރާ ޖީން މީއުޓޭޝަން ނުވަތަ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑައިނަމިކްސް އާއި ގުޅުންހުރި ޖީން ޑިސްޓްރަކްޝަން ގެ ސަބަބުންނެވެ. ޖަނަވާރުގެ މޮޑެލްތަކުގައި ކުރި މަސައްކަތުން ދައްކާފައިވާ ގޮތުގައި ވަށައިގެންވާ ޓިޝޫތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން އަށް ރައްދުދީ ކޮންޒަރވޭޓިވް މެޓަބޮލިކް މަގުތައް (5-7) އެކްޓިވޭޓްވެ، މި ކޮމްޕްލެކްސް ބަލިތަކުގެ ޕެތޯޖެނެސިސްއާ ބެހޭ މުހިންމު ވިސްނުންތަކެއް ލިބިގެންދެއެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް، ސިކުނޑީގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެޑިނޯސިން ޓްރައިފޮސްފޭޓް (އޭޓީޕީ) އުފެއްދުމުގެ އާންމު ނާކާމިޔާބީގެ ސަބަބުން ވަކި ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ބަދަލުތަކާ ބެހޭގޮތުން އަޅުގަނޑުމެންނަށް ދެނެގަތުމަކީ އަސާސީ ކަމެއް (8) ކަމަށާއި، ބަލި ހުއްޓުވުމަށް ނުވަތަ ބަލި ހުއްޓުވުމަށް ބޭނުންކުރެވޭނެ ފަރުވާގެ އަމާޒުތައް ދެނެގަތުމަށް ބާރުއަޅާ ކަމަށެވެ. ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން ހުއްޓުވުން (9). މައުލޫމާތު ނެތުމަކީ ވަށައިގެންވާ ޓިޝޫތަކުގެ ސެލް ވައްތަރުތަކާ އަޅާބަލާއިރު ނާރު ސެލްތަކުގައި މެޓަބޮލިކް ފްލެކްސިބިލިޓީ ވަރަށް މަދު ކަމަށް ގިނަ ބަޔަކު ގަބޫލުކުރާ ކަމެވެ ( 10 ). މި ސެލްތަކުން ސިނެޕްޓިކް ޓްރާންސްމިޝަން ކުރިއެރުވުމަށާއި އަނިޔާއާއި ބަލީގެ ހާލަތްތަކަށް ރައްދުދިނުމަށްޓަކައި ނިއުރޯންތަކަށް މެޓަބޮލައިޓް ފޯރުކޮށްދިނުމުގައި މައިގަނޑު ދައުރެއް އަދާކުރާ ކަމަށް ބަލާއިރު، ސިކުނޑީގެ ޓިޝޫގެ ގޮންޖެހުން ބޮޑު ހާލަތްތަކަށް ސެލް މެޓަބޮލިޒަމް އެޑެޕްޓް ކުރުމުގެ ޤާބިލުކަން ގާތްގަނޑަކަށް ގްލިއަލް ސެލްތަކަށް ޙައްދުވެއެވެ (11-14). މީގެ އިތުރުން ސިކުނޑީގެ ޓިޝޫތަކުގައި ހުންނަ ސެލްއުލަރ ހެޓަރޮޖެނިޓީގެ ސަބަބުން ވަކި ނިއުރޯނަލް ސަބްގްރޫޕްތަކެއްގައި ދިމާވާ މެޓަބޮލިކް ބަދަލުތައް ދިރާސާކުރުމަށް ވަރަށް ބޮޑަށް ހުރަސްއެޅެއެވެ. ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ނިއުރޯންތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ސަބަބުން ސީދާ ސެލްއުލަރ އަދި މެޓަބޮލިކް ނަތީޖާތަކާ ބެހޭގޮތުން އެނގޭ އެއްޗެއް މަދުވެއެވެ.
މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ މެޓަބޮލިކް ނަތީޖާތައް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި، މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އައުޓަރ މެމްބަރޭން ފިއުޝަން (Mfn2) ހަލާކުވުމުގެ ސަބަބުން ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަންގެ އެކި މަރުހަލާތަކުގައި ޕަރކިންޖޭ ނިއުރޯން (PNs) އެކަހެރިކުރިއެވެ. އިންސާނުންގެ ގައިގައި Mfn2 ގެ މުއުޓޭޝަންތައް ޗާކޯޓް-މެރީ-ޓޫތު ޓައިޕް 2A (15) ގެ ނަމުން މަޝްހޫރު ހެރިޑިޓޭރީ މޮޓޯ ސެންސަރީ ނިއުރޯޕެތީގެ ވައްތަރަކާ ގުޅިފައިވާ ނަމަވެސް، މަސްތަކުގައި Mfn2 ޝަރުތުކޮށްގެން ނައްތާލުމަކީ އޮކްސިޑޭޝަން ފޮސްފޮރައިލޭޝަން (OXPHOS) ޑިސްފެންޝަން މެތެޑެއް ކަމަށް ރަނގަޅަށް ދެނެގަނެވިފައިވެއެވެ. އެކި ނިއުރޯނަލް ސަބްޓައިޕްސް (16-19) އާއި އޭގެ ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން އުފެދޭ ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޓިވް ފީނޯޓައިޕް އާއި އެކު ޕްރޮގްރެސިވް ނިއުރޮލޮޖިކަލް އަލާމާތްތައް ކަމަށްވާ މޫވްމަންޓް ޑިސްއޯޑަރސް (18، 19) ނުވަތަ ސެރެބިލަރ އެޓޭކްސިއާ (16) ފަދަ އަލާމާތްތައް ފެނެއެވެ. ލޭބަލް ފްރީ ކުއަންޓިޓޭޓިވް (އެލްއެފްކިޔު) ޕްރޮޓީއޮމިކްސް، މެޓަބޮލޮމިކްސް، އިމޭޖިންގ، އަދި ވައިރޮލޮޖިކަލް މެތެޑްސް އެއްކޮށްގެން އަޅުގަނޑުމެން ދައްކާ ގޮތުގައި ޕްރޮގްރެސިވް ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން އިން ޕައިރޫވޭޓް ކާރބޮކްސައިލޭޒް (PCx) އާއި ޕީއެންސް ގެ އާޓިރިއޮސްކްލޮރޯސިސް ގައި ބައިވެރިވާ އެހެން ކަންތައްތައް އިން ވިވޯ އިން ވަރަށް ބޮޑަށް އިންޑައުސް ކުރެއެވެ. މި ހޯދުމުގެ ގުޅުން ޔަގީންކުރުމަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން ވަކިން ޚާއްޞަކޮށް Mfn2 ނެތް ޕީއެންތަކުގައި ޕީސީއެކްސްގެ އެކްސްޕްރެޝަން ޑައުން ރެގިއުލޭޓްކޮށް، މި އޮޕަރޭޝަންގެ ސަބަބުން އޮކްސިޑޭޓިވް ސްޓްރެސް ގޯސްވެ، ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން އަވަސްވެ، އެޒޯސްޕަރމިއާ އިން ސެލް މަރުވުން މެޓަބޮލިކް އެޑެޕްޓޭބިލިޓީ ލިބޭކަން ސާބިތުވިއެވެ. އެމްއެފްއެން2 ގެ ސީރިއަސް އެކްސްޕްރެޝަން އިން ޓާރމިނަލް ޑިޖެނެރޭޝަން ޕީއެން މުޅިން ސަލާމަތް ކުރެވޭނީ ސީރިއަސް އޮކްސްފޯސް ޑެފިޝަންސީ އާއި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑީއެންއޭ ގިނައިން ބޭނުންކުރުމާއި، ފެންނަ ފެނުމުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ނެޓްވޯކް ފަޅައިގެން ގޮސްފައިވާ ކަމެވެ.
Mfn2 ނޮކްއައުޓް ޕީއެން ތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއާ ވިޝުއަލައިޒް ކުރުމަށްޓަކައި، Cre-ޑިޕެންޑެންޓް މައިޓޮކޮންޑްރިއާ އަށް ޔެލޯ ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން (YFP) (mtYFP) (20) Cre އެކްސްޕްރެޝަނަށް އަމާޒުކޮށްގެން މައުސް ސްޓްރޭން އެއް ބޭނުންކޮށްގެން އިން ވިވޯ އިން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މޯރފޮލޮޖީ ޗެކް ކުރިން. އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި ޕީއެން ތަކުގައި Mfn2 ޖީން ނައްތާލުމުން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ނެޓްވޯކް މަޑުމަޑުން ބައިބައިވެގެން ދާނެ ކަމަށާއި ( ފޮޓޯ S1A ) އެންމެ ކުރީކޮޅު ބަދަލު ފެނިފައިވަނީ އުމުރުން 3 ހަފްތާގައެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް ކެލްބިންޑިން އިމިއުނޯސްޓޭނިންގ ގެއްލުމުން ސާބިތުވާ ގޮތުގައި ޕީއެން ސެލް ފަށަލަ ބޮޑުތަނުން ޑިޖެނެރޭޓްވުން އުމުރުން 12 ހަފްތާގައި ފެށިގެން ނުދެއެވެ ( ފޮޓޯ 1، އޭ އަދި ބީ ). މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މޯރފޮލޮޖީއަށް އައި އެންމެ ކުރީގެ ބަދަލުތަކާއި ނިއުރޯނަލް މަރު ފެންނަން ފެށުމާ ދެމެދު ވަގުތު ތަފާތުވުމުން ސެލް މަރުވުމުގެ ކުރިން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ސަބަބުން އުފެދޭ މެޓަބޮލިކް ބަދަލުތައް ތަހުގީގު ކުރުމަށް ބާރުއެޅިއެވެ. އަހަރެމެން ވައިއެފްޕީ (ވައިއެފްޕީ+) އެކްސްޕްރެސް ކުރާ ޕީއެން (ފޮޓޯ 1ސީ)، އަދި ކޮންޓްރޯލް މައިސް (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ގައި، މީގެ ފަހުން ސީޓީއާރުއެލް (ފޮޓޯ S1B) ގެ ނަމުން ނަންދެވިފައިވާ، އައިސޮލޭޓް ކުރުމަށް ފްލޫރެސެންސް އެކްޓިވޭޓެޑް ސެލް ސޯޓިންގ (އެފްއޭސީއެސް) އަށް ބިނާކޮށް ސްޓްރެޓެޖީއެއް ތަރައްޤީ ކުރިން. ވައިއެފްޕީ ސިގްނަލްގެ ރިލޭޓިވް އިންޓެންސިޓީއަށް ބިނާކޮށް ގޭޓިންގ ސްޓްރެޓެޖީ އޮޕްޓިމައިޒް ކުރުމުން ނޮން-ޕީއެންސް (ވައިއެފްޕީނެގް) (ފޮޓޯ S1B) ނުވަތަ ޕިއުޓޭޓިވް ފްލޫރެސްސެންޓް އެކްސަން/ޑެންޑްރިޓިކް ފްރެގްމެންޓްސް (YFPlow; ފޮޓޯ S1D، ކަނާތް) އިން ޕީއެންތަކުގެ ވައިއެފްޕީ+ ބޮޑީ (YFPhigh) ޕިއުރިފައި ކުރެވޭނެއެވެ. ކްލަސިފައިޑް ޕޮޕިއުލޭޝަންގެ އައިޑެންޓިޓީ ޔަގީންކުރުމަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން އެލްއެފްކިޔޫ ޕްރޮޓީއޮމިކްސް އަދި ދެން ޕްރިންސިޕަލް ކޮމްޕޮނެންޓް އެނަލިސިސް ކުރިއަށް ގެންދިޔައިރު، ވައިއެފްޕަހައި އަދި ވައިއެފްޕީނެގް ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ސާފު ވަކިވުމެއް އޮތްކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ (ފޮޓޯ S1C). ވައިއެފްޕީހައި ސެލްތަކުން އެނގޭ ޕީއެންސް މާކެރސް (އެބަހީ Calb1، Pcp2، Grid2 އަދި Itpr3) ގެ ނެޓް އެންރިޗްމަންޓް ފެނިފައިވީނަމަވެސް އާންމުކޮށް ނިއުރޯންތަކުގައި ނުވަތަ އެހެން ސެލް ވައްތަރުތަކުގައި އެކްސްޕްރެސްވާ ޕްރޮޓީންތަކުގެ އެންރިޗްމަންޓެއް ނުފެނުނެވެ (ފޮޓޯ 1ޑީ) ). މިނިވަން ތަޖުރިބާތަކުގައި އެއްކުރި ކްލަސިފައިޑް ވައިއެފްޕީހައި ސެލްތަކުގައި ހުރި ސާމްޕަލްތަކުގެ މެދުގައި އަޅާކިޔުމުން ކޯރިލޭޝަން ކޯއެފިޝަން> 0.9 ފެނިފައިވާއިރު، މިއީ ބަޔޮލޮޖިކަލް ރިޕްލިކޭޓްތަކުގެ މެދުގައި ރަނގަޅު ރިޕްރޮޑަކްޓިބިލިޓީއެއް ދައްކުވައިދޭ ކަމެކެވެ (ފޮޓޯ S1E). ޚުލާޞާކޮށް ދަންނަވާނަމަ، މި ޑޭޓާތަކުން އަޅުގަނޑުމެންގެ ޕްލޭން ސައްޙަކޮށްދިނީ، ފީސިބަލް ޕީއެންގެ އެކިއުޓް އަދި ސްޕެސިފިކް އައިސޮލޭޝަން އަށެވެ. ބޭނުންކުރި L7-cre ޑްރައިވަރ ސިސްޓަމް ވިހެއުމަށްފަހު ފުރަތަމަ ހަފްތާގައި މޮޒައިކް ރިކޮމްބިނޭޝަން އިންޑައުސް ކުރާތީ (23)، އަހަރެމެން ސީޓީއާރުއެލް އިން މަސްތައް ކަލްކޮށް ކޮންޑިޝަނަލް (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ނިއުރޯންތައް އެއްކުރަން ފެށީމެވެ. ރިކޮމްބިނޭޝަން ނިމުމުން އުމުރުން 4 ހަފްތާގައި ކިޔަނީ Mfn2cKO އެވެ. ނިމުމުގައި ފާހަގަކުރެވޭ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފްރެގްމެންޓްތައް ހުރި ނަމަވެސް ޕީއެން ލޭޔަރ އަދިވެސް އެއްގޮތަކަށް ހުރި 8 ހަފްތާގެ އުމުރު އަޅުގަނޑުމެން ހޮވާފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 1ބީ އަދި ފޮޓޯ S1A ). ޖުމްލަކޮށް ބަލާއިރު، އަޅުގަނޑުމެން ޖުމްލަ 3013 ޕްރޮޓީން ކިއުއަންޓައިޒް ކުރިއިރު، އޭގެ ތެރެއިން ގާތްގަނޑަކަށް %22 ޕްރޮޓީން ބިނާވެފައިވަނީ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕްރޮޓީއޯމް އަށް މައިޓޯކޮންޑްރިއާގެ ގޮތުގައި މައިޓޯކާޓާ 2.0 އެނޮޓޭޝަންތަކުގެ މައްޗަށެވެ (ފޮޓޯ 1އީ) (ފޮޓޯ 1އީ) (24). 8 ވަނަ ހަފްތާގައި ކުރިއަށް ގެންދިޔަ ޑިފެރެންޝަލް ޖީން އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސްއިން ދައްކާ ގޮތުގައި ހުރިހާ ޕްރޮޓީންތަކުގެ %10.5 އަށް މާބޮޑު ބަދަލުތަކެއް އައިސްފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 1އެފް އަދި ފޮޓޯ S1F ). ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ މި ޑޭޓާ ސެޓްގެ “އިނޮވޭޓިވް ޕަތްވޭ އެނަލިސިސް” އިން ދައްކާ ގޮތުގައި ޑިފެރެންޝަލްކޮށް އެކްސްޕްރެސް ކުރެވޭ ޖީންތައް މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ނިސްބަތްވަނީ ވަކި މެޓަބޮލިކް ޕަތްވޭތަކުގެ ރެސްޓްރިކްޓެޑް ސެޓަކަށް ކަމަށް ވެއެވެ (ފޮޓޯ 1ޖީ). ޝައުޤުވެރިވާ ކަމަކީ، އޮކްސްފޯސް އަދި ކެލްސިއަމް ސިގްނަލިންގ އާއި ގުޅުންހުރި މަގުތަކުގެ ޑައުން ރެގިއުލޭޝަން އިން ފިއުޝަން ނެތް ޕީއެން ތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން އިންޑަކްޝަން ކަށަވަރުވި ނަމަވެސް، މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި އެމިނޯ އެސިޑް މެޓަބޮލިޒަމް ހިމެނޭ އެހެން ކެޓަގަރީތައް ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ވެއެވެ. ރީވައިރިންގ އަކީ އެއްގޮތެވެ. ޑިސްފެންޝަން ވުމެވެ.
(އ) ސީޓީއާރުއެލް އަދި އެމްއެފްއެން2ސީކޭއޯ މަސްތަކުގެ ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންތަކުގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ކޮންފޯކަލް ފޮޓޯތަކުން ޕީއެންސް (ކެލްބިންޑިން، ގްރޭ) ގެ ޕްރޮގްރެސިވް ލޮސް ފެންނަ މަންޒަރު؛ ނިއުކްލިއަސްތައް ކައުންޓަރސްޓޭއިން ކޮށްފައިވަނީ ޑީއޭޕީއައި އިންނެވެ. (ބ) (އޭ) ގެ ކުއަންޓިފިކޭޝަން (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް، ***P<0.001؛ n = 4 އިން 6 ސަރކަލްސް ފްރޮމް ތިން މައިސް). (ސ) ތަޖުރިބާގެ ވޯކްފްލޯ. (ޑ) ޕަރކިންޖޭ (މަތީގައި) އަދި އެހެން ސެލް ވައްތަރުތަކަށް ޚާއްޞަ މާކެރުގެ ހީޓް މެޕް ޑިސްޓްރިބިއުޝަން (މެދު) . (އީ) ކްލަސިފައިޑް ޕީއެން ގައި ފާހަގަކުރެވޭ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕްރޮޓީންތަކުގެ އަދަދު ދައްކުވައިދޭ ވެން ޑައިގްރާމް. (އެފް) 8 ހަފްތާގައި Mfn2cKO ނިއުރޯންތަކުގައި ޑިފެރެންޝަލްކޮށް އެކްސްޕްރެސް ކުރެވިފައިވާ ޕްރޮޓީންތަކުގެ އަލިފާންގަނޑު ޕްލޮޓް (ސިގްނިފިކޭންސް ކަޓް-އޮފް ވެލިއު 1.3). (ގ) ކްރިއޭޓިވިޓީ ޕަތްވޭ އެނަލިސިސް އިން ފެންނަނީ 8 ހަފްތާގެ ގޮތުގައި ގިންތިކުރެވިފައިވާ Mfn2cKO PN ގައި ހުރި އެންމެ މުހިންމު ފަސް އަޕް-ރެގިއުލޭޝަން (ރަތް) އަދި ޑައުން-ރެގިއުލޭޝަން (ނުވަތަ ބްލޫ) މަގުތަކެވެ. ފާހަގަކުރެވޭ ކޮންމެ ޕްރޮޓީނެއްގެ އެވްރެޖް އެކްސްޕްރެޝަން ލެވެލް ދައްކާފައިވެއެވެ. ގްރޭސްކޭލް ހީޓް މެޕް: އެޖެސްޓްޑް ޕީ ވެލިއު. ns، މުހިންމު ނޫން.
ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާއިން ދައްކާ ގޮތުގައި ކޮމްޕްލެކްސް I، III، އަދި IV ގެ ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން މަޑުމަޑުން ދަށްވަމުން ދިޔައެވެ. ކޮމްޕްލެކްސް I، III، އަދި IV ގައި ވެސް ކޮންމެހެން ބޭނުންވާ އެމްޓީޑީއެންއޭ އިންކޯޑް ކުރެވިފައިވާ ސަބްޔުނިޓްތައް ހުރިއިރު، ހަމައެކަނި ނިއުކްލިއަރ ކޯޑް ކުރެވިފައިވާ ކޮމްޕްލެކްސް II އަށް އަސާސީ ގޮތުން އަސަރެއް ނުކުރިއެވެ ( ފޮޓޯ 2އޭ އަދި ފޮޓޯ S2A ). . ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ނަތީޖާތަކާ އެއްގޮތަށް ސެރެބިލަރ ޓިޝޫ ސެކްޝަންތަކުގެ އިމިއުނޯހިސްޓޯކެމިސްޓްރީން ދައްކާ ގޮތުގައި ޕީއެންގައި ކޮމްޕްލެކްސް އައިވީގެ އެމްޓީސީއޯ1 (މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ސައިޓޮކްރޯމް ސީ އޮކްސިޑޭޒް ސަބްޔުނިޓް 1) ސަބްޔުނިޓް ލެވެލް މަޑުމަޑުން ދަށްވެއެވެ (ފޮޓޯ 2ބީ). އެމްޓީޑީއެންއޭ އިންކޯޑް ކުރެވިފައިވާ ސަބްޔުނިޓް Mtatp8 ވަރަށް ބޮޑަށް ދަށްވެފައިވާއިރު (ފޮޓޯ S2A) ނިއުކްލިއަރ އިންކޯޑް ކުރެވިފައިވާ އޭޓީޕީ ސިންތޭޒް ސަބްޔުނިޓްގެ ސްޓޭޑި-ސްޓޭޓް ލެވެލް އަށް ބަދަލެއް ނާދެއެވެ. ފޯމޭޝަން އެއްގޮތެވެ. މެދުކަނޑާލުން (7). ރިއަލް ޓައިމް ޕޮލިމިރޭޒް ޗޭން ރިއެކްޝަން (qPCR) އިން ސޯޓް ކުރެވިފައިވާ Mfn2cKO PN ތަކުގައި mtDNA ލެވެލް އިވެލުއޭޓް ކުރުމުން mtDNA ކޮޕީ ނަންބަރު މަޑުމަޑުން ދަށްވާކަން ކަށަވަރުވެފައިވެއެވެ. ކޮންޓްރޯލް ގްރޫޕާ އަޅާބަލާއިރު، އުމުރުން 8 ހަފްތާގައި، އެމްޓީޑީއެންއޭ ލެވެލްގެ ގާތްގަނޑަކަށް %20 އެކަނި ހިފެހެއްޓިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 2ސީ). މި ނަތީޖާތަކާ އެއްގޮތަށް، ޑީއެންއޭ ހޯދުމަށް Mfn2cKO PNs ގެ ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕީ ސްޓޭނިންގ އިން ދައްކާގޮތުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ނިއުކްލިއޯޓައިޑްސް ވަގުތަށް ބަރޯސާވާ މިންވަރު ފާހަގަކުރެވެއެވެ ( ފޮޓޯ 2ޑީ ). އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕްރޮޓީން ޑިގްރެޑޭޝަން އަދި ސްޓްރެސް ރިސްޕޮންސްގައި ބައިވެރިވާ ބައެއް ކެންޑިޑޭޓުން އަޕް-ރެގިއުލޭޓް ވެފައި ވާއިރު، އޭގެ ތެރޭގައި Lonp1، Afg3l2 އަދި Clpx، އަދި OXPHOS ކޮމްޕްލެކްސް އެސެމްބްލީ ފެކްޓަރސް ހިމެނެއެވެ. އެޕޮޕްޓޮސިސްގައި ބައިވެރިވާ ޕްރޮޓީންތަކުގެ މިންވަރަށް މާބޮޑު ބަދަލެއް އައިސްފައެއް ނުވެއެވެ (ފޮޓޯ S2B). ހަމައެފަދައިން ކެލްސިއަމް ދަތުރުކުރުމުގައި ބައިވެރިވާ މައިޓޮކޮންޑްރިއާ އާއި އެންޑޯޕްލާސްމިކް ރެޓިކިއުލަމް ޗެނަލްތަކަށް ވެސް ކުދިކުދި ބަދަލުތަކެއް އަންނަކަން އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފާހަގަކުރެވުނެވެ ( ފޮޓޯ S2C ). މީގެ އިތުރުން އޮޓޯފޭޖީއާ ގުޅުންހުރި ޕްރޮޓީންތައް އިވެލުއޭޓް ކުރުމުގައި މާބޮޑު ބަދަލެއް އައިސްފައި ނުވާއިރު، މިއީ އިމިއުނޯހިސްޓޯކެމިސްޓްރީ އަދި އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޮސްކޯޕީ އިން އިން ވިވޯގައި ފެންނަ އޮޓޯފޭގޯސޯމްތަކުގެ ފެންނަ އިންޑަކްޝަން އާއި އެއްގޮތް ކަމެކެވެ ( ފޮޓޯ S3 ). ނަމަވެސް ޕީއެން ތަކުގައި ޕްރޮގްރެސިވް އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަން އާއި އެކު ފާހަގަ ކުރެވޭ އަލްޓްރާސްޓްރަކްޗަރަލް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ބަދަލުތަކެއް އަންނަ ކަމަށް ވެސް ޑރ. އުމުރުން 5 އަދި 8 ހަފްތާގެ Mfn2cKO PNs ގެ ސެލް ބޮޑީސް އަދި ޑެންޑްރިޓިކް ޓްރީސް އިން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ކްލަސްޓަރސް ފެންނައިރު، އެތެރޭގެ މެމްބަރޭން ސްޓްރަކްޗަރ އަށް ފުން ބަދަލުތަކެއް އައިސްފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ S4، A އަދި B ). މި އަލްޓްރާސްޓްރަކްޗަރަލް ބަދަލުތަކާއި އެމްޓީޑީއެންއޭ ވަރަށް ބޮޑަށް ދަށްވުމާ އެއްގޮތަށް، ޓެޓްރަމެތައިލްރޯޑަމިން މެތައިލް އެސްޓަރ (ޓީއެމްއާރްއެމް) އިން އެކިއުޓް ސެރެބްރަލް ސެރެބިލަރ ސްލައިސްތައް ތަޙުލީލުކުރުމުން Mfn2cKO PNs ގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މެމްބަރޭން ޕޮޓެންޝަލް ވަރަށް ބޮޑަށް ދަށްވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ (ފޮޓޯ S4C).
(އ) އޮކްސްފޯސް ކޮމްޕްލެކްސްގެ އެކްސްޕްރެޝަން ލެވެލްގެ ޓައިމް ކޯސް އެނަލިސިސް. ހަމައެކަނި 8 ހަފްތާގައި P<0.05 ހުންނަ ޕްރޮޓީންތަކަށް ބަލާށެވެ (ޓޫ-ވޭ އެނޯވާ) އެވެ. ޑޮޓް ލައިން: ސީޓީއާރުއެލް އާއި އަޅާބަލާއިރު އެޖެސްޓްމަންޓެއް ނެތެވެ. (ބ) ކަނާތް: އެންޓި-އެމްޓީސީއޯ1 އެންޓިބޮޑީ (ސްކޭލް ބާރ، 20 μm) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންގެ މިސާލެކެވެ. ޕަރކިންޖޭ ސެލް ހަށިގަނޑުތައް ހިފާފައިވާ ސަރަހައްދަކީ ރީނދޫ ކުލައިން ނިވާކޮށްފައިވާ ސަރަހައްދެކެވެ. ކަނާތް: އެމްޓީސީއޯ1 ލެވެލް ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބެލުން (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ n = 7 އިން 20 ސެލްސް އެނަލައިޒްޑް ފްރޮމް ތިން މައިސް) . (ސީ) ސޯރޓް ކުރެވިފައިވާ ޕީއެންގައި އެމްޓީޑީއެންއޭ ކޮޕީ ނަންބަރުގެ qPCR ތަޙުލީލު (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ n = 3 އިން 7 މައިސް) . (ޑ) ކަނާތް: އެންޓި-ޑީއެންއޭ އެންޓިބޮޑީ (ސްކޭލް ބާރ، 20 μm) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ސެރެބިލަރ ސްލައިސްގެ މިސާލެކެވެ. ޕަރކިންޖޭ ސެލް ހަށިގަނޑުތައް ހިފާފައިވާ ސަރަހައްދަކީ ރީނދޫ ކުލައިން ނިވާކޮށްފައިވާ ސަރަހައްދެކެވެ. ކަނާތް: އެމްޓީޑީއެންއޭ ލޭޝަންސް ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބެލުން (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ n = 5 އިން 9 ސެލްސް ތިން މައިސް އިން). (އީ) މުޅި ސެލް ޕެޗް ކްލެމްޕް ރެކޯޑިންގއެއްގައި މައިޓޯވައިއެފްޕީ + ޕަރކިންޖޭ ސެލްތައް (ތިރިއަށް ދައްކާފައިވާ ތިރިއަށް ދައްކާފައިވާ ތިރިއަށް) ދައްކުވައިދޭ ސީރިއަސް ސެރެބިލަރ ސެކްޝަނެއްގެ މިސާލެކެވެ. (ފ) އައިވީ ކަރވްގެ މިންވަރު ކަނޑައެޅުން. (ގ) ސީޓީއާރުއެލް އަދި އެމްއެފްއެން2ސީކޭއޯ ޕަރކިންޖޭ ސެލްތަކުގައި ޑިޕޮލަރައިޒިންގ ކަރަންޓް އިންޖެކްޝަންގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ރެކޯޑިންގސް. ޓޮޕް ޓްރޭސް: އޭޕީ ޓްރިގަރ ކުރި ފުރަތަމަ ޕަލްސް. ތިރީ ޓްރޭސް: އެންމެ ގިނައިން އޭޕީ ފްރީކުއެންސީ. (ހ) ޕޯސްޓްސިނެޕްޓިކް ސްޕޮންޓެނިއަސް އިންޕުޓްސް (sPSPs) ގެ މިންވަރު ކަނޑައެޅުން. ތަމްސީލު ރެކޯޑިންގ ޓްރޭސް އާއި އޭގެ ޒޫމް ރޭޝިއޯ (I) ގައި އެވަނީއެވެ. ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް އެނަލައިޒް ކޮށްފައިވަނީ ތިން މަސްތަކުން n = 5 އިން 20 ސެލްސް އެވެ. ޑޭޓާ ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން±ސެމް ގެ ގޮތުގައެވެ؛ *ޕީ<0.05؛ **ޕީ<0.01؛ ***ޕީ<0.001. (ޖ) ޕަރފޯރޭޓެޑް ޕެޗް ކްލެމްޕް މޯޑް ބޭނުންކޮށްގެން ރެކޯޑްކުރެވިފައިވާ އަމިއްލައަށް އުފެދޭ އޭޕީގެ ތަމްސީލު ޓްރޭސްތައް. މަތީ ޓްރޭސް: އެންމެ ގިނައިން އޭޕީ ފްރީކުއެންސީ. ތިރީ ޓްރޭސް: އެއް އޭޕީއެއްގެ ޒޫމް. (ކ) (ޖޭ) އަށް ބަލައިގެން އެވްރެޖް އަދި މެކްސިމަމް އޭޕީ ފްރީކުއެންސީ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބެލުން. މާން-ވިޓްނީ ޓެސްޓް؛ n = 5 ސެލް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ ހަތަރު މަސްތަކުންނެވެ. ޑޭޓާ ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން±ސެމް ގެ ގޮތުގައެވެ؛ މުހިންމެއް ނޫނެވެ.
8 ހަފްތާގެ Mfn2cKO PN ގައި ފާޅުކަން ބޮޑު ގޮތެއްގައި OXPHOS ގެ ގެއްލުން ފެނިފައިވާއިރު، މިއީ ނިއުރޯންތަކުގެ ފިޒިއޮލޮޖިކަލް ފުންކްޝަން ވަރަށް ބޮޑަށް އާދަޔާ ހިލާފު ކަމެއް ކަމަށް ދައްކައެވެ. އެހެންކަމުން، އެކިއުޓް ސެރެބިލަރ ސްލައިސްތަކުގައި ހޯލް ސެލް ޕެޗް ކްލެމްޕް ރެކޯޑިންގތައް ހަދައިގެން 4 އާއި 5 ހަފްތާއާއި 7 އާއި 8 ހަފްތާއާ ދެމެދުގެ މުއްދަތެއްގައި އޮކްސްފޯސް ނެތް ނިއުރޯންތަކުގެ ޕޭސިވް އިލެކްޓްރިކަލް ސިފަތައް ތަޙުލީލުކުރިން (ފޮޓޯ 2އީ) އެވެ. ހީވެސް ނުކުރާ ގޮތަކަށް Mfn2cKO ނިއުރޯންތަކުގެ އެވްރެޖް ރެސްޓިންގ މެމްބަރޭން ޕޮޓެންޝަލް އަދި އިންޕުޓް ރެސިސްޓެންސް ކޮންޓްރޯލް އާއި އެއްގޮތް ނަމަވެސް ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ކުދިކުދި ތަފާތުތަކެއް ހުއްޓެވެ (ތާވަލް 1). ހަމައެފަދައިން އުމުރުން 4 ހަފްތާއާއި 5 ހަފްތާއާ ދެމެދުގެ އުމުރުގައި ކަރަންޓް-ވޯލްޓޭޖް ގުޅުމަށް (IV ކަރވް) މާބޮޑު ބަދަލެއް އައިސްފައެއް ނުވެއެވެ (ފޮޓޯ 2އެފް). ނަމަވެސް 7 ހަފްތާއާއި 8 ހަފްތާއާ ދެމެދުގެ އެއްވެސް Mfn2cKO ނިއުރޯނެއް އައިވީ ރެޖިމަން (ހައިޕަރޕޮލަރައިޒޭޝަން ސްޓެޕް) އިން ސަލާމަތް ނުވުމުން، މި ފަހު މަރުހަލާގައި ހައިޕަރޕޮލަރައިޒޭޝަން ޕޮޓެންޝަލް އަށް ސާފު ނާޒުކުކަން ހުރިކަން ހާމަވެއެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް Mfn2cKO ނިއުރޯންތަކުގައި ރިޕީޓިވް އެކްޝަން ޕޮޓެންޝަލް (AP) ޑިސްޗާޖް އުފެދޭ ޑިޕޮލަރައިޒިންގ ކަރަންޓްތައް ރަނގަޅަށް ޓޮލަރޭޓް ކުރެވޭތީ، އެމީހުންގެ ޖުމްލަ ޑިސްޗާޖް ޕެޓަރންސް 8 ހަފްތާގެ ކޮންޓްރޯލް ނިއުރޯންތަކާ މާބޮޑު ތަފާތެއް ނެތްކަން ދައްކައެވެ (ތާވަލް 1 އަދި ފޮޓޯ 2G). ހަމައެފަދައިން ސްޕޮންޓެނިއަސް ޕޯސްޓްސިނެޕްޓިކް ކަރަންޓްސް (sPSCs) ގެ ފްރީކުއެންސީއާއި އެމްޕްލިޓިއުޑް ކޮންޓްރޯލް ގްރޫޕްގެ ފްރީކުއެންސީއާއި އަޅާކިޔާއިރު، 4 ހަފްތާއިން 5 ހަފްތާއިން 7 ހަފްތާއިން 8 ހަފްތާއަށް އިތުރުވެފައިވަނީ މިފަދަ އިތުރުވުމަކާއެކުގައެވެ (ފޮޓޯ 2، އެޗް އަދި އައި). ޕީއެންތަކުގައި ސިނެޕްޓިކް މެޗުރޭޝަންގެ މުއްދަތު ( 25 ). މިފަދަ ނަތީޖާތަކެއް ލިބިފައިވަނީ ޕަރފޯރޭޓް ޕީއެންސް ޕެޗްތަކަށްފަހުގައެވެ. މި ކޮންފިގްރޭޝަންގެ ސަބަބުން ހޯލް ސެލް ޕެޗް ކްލެމްޕް ރެކޯޑިންގ ގައި ދިމާވެދާނެ ފަދައިން ސެލްއުލަރ އޭޓީޕީ ޑިފެކްޓްސް ގެ ކޮމްޕެންސޭޝަން އަށް ހުރަސްއެޅެއެވެ. ޚާއްޞަކޮށް Mfn2cKO ނިއުރޯންތަކުގެ ރެސްޓިންގ މެމްބަރޭން ޕޮޓެންޝަލް އަދި އަމިއްލައަށް ފަޔަރ ކުރުމުގެ ފްރީކުއެންސީއަށް އެއްވެސް އަސަރެއް ނުކުރިއެވެ ( ފޮޓޯ 2، ޖޭ އަދި ކޭ ). ޚުލާޞާކޮށް ދަންނަވާނަމަ، މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކާގޮތުގައި އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަން ފާހަގަކުރެވޭ ޕީއެން ތަކަށް ހައި ފްރީކުއެންސީ ޑިސްޗާޖް ޕެޓަރންތަކާ ރަނގަޅަށް ކުރިމަތިލެވޭ ކަމާއި، މިއީ އާދައިގެ އިލެކްޓްރޯފިޒިއޮލޮޖިކަލް ރިސްޕޮންސްތައް ގާތްގަނޑަކަށް ބެހެއްޓުމަށް ފުރުޞަތު ލިބޭ ކޮމްޕެންސޭޝަން މެކޭނިޒަމެއް އޮތްކަން ހާމަކޮށްދޭ ކަމެކެވެ.
ޑޭޓާ ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން ± SEM (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް، ހޯމް-ސިޑަކްގެ މަލްޓިޕަލް ކޮމްޕެރިޝަން ޓެސްޓް؛ *P<0.05) ގެ ގޮތުގައެވެ. ޔުނިޓް ނަންބަރު ދައްކާފައިވަނީ ބްރެކެޓްތަކުންނެވެ.
އަޅުގަނޑުމެން ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާސެޓް (ފޮޓޯ 1ޖީ) ގެ އެއްވެސް ކެޓަގަރީއެއްގައި އޮކްސްފޯސްގެ ސީރިއަސް ޑެފިޝަންސީއާ ދެކޮޅަށް މަސައްކަތްކުރެވޭނެ މަގުތައް ހިމެނޭތޯ ބެލުމަށް ނިކުތީ، އެކަމުގެ ސަބަބުން އަސަރުކުރާ ޕީއެން އަށް އާދައިގެ އިލެކްޓްރޯފިޒިއޮލޮޖީ ދަމަހައްޓަން ޖެހޭ ސަބަބު ހާމަކުރުމަށެވެ (ފޮޓޯ 2، އީ އިން ކޭ) އެވެ. . ޕްރޮޓީއޮމިކްސް އެނަލިސިސް އިން ދައްކާ ގޮތުގައި ބްރާންޗްޑް ޗޭން އެމިނޯ އެސިޑް (ބީސީއޭއޭ) ގެ ކެޓަބޮލިޒަމްގައި ބައިވެރިވާ އެންޒައިމްތައް ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ވެފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 3އޭ އަދި ފޮޓޯ S5A)، އަދި ފައިނަލް ޕްރޮޑަކްޓް އެސިޓައިލް-ކޯއޭ (ކޯއޭ) ނުވަތަ ސުކްސިނިލް ކޯއޭ އިން އާޓިރިއޯސްކްލޮރޯސިސް އެސިޑް (ޓީސީއޭ) ސައިކަލްގައި ޓްރައިކާރބޮކްސައިލެޓްސް ސަޕްލިމެންޓް ކުރެވިދާނެއެވެ. އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި ބީސީއޭއޭ ޓްރާންސްއެމިނޭޒް 1 (ބީސީއޭޓީ1) އަދި ބީސީއޭޓީ2 ގެ ވެސް މިންވަރު އިތުރުވެއެވެ. އެމީހުން ބީސީއޭއޭ ކެޓަބޮލިޒަމްގެ ފުރަތަމަ ފިޔަވަޅު ކެޓަލައިޒް ކުރީ α-ކެޓޯގްލޫޓޭރޭޓް އިން ގްލޫޓާމޭޓް އުފައްދައިގެންނެވެ ( 26 ). ބްރާންޗްޑް ޗޭން ކީޓޯ އެސިޑް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް (BCKD) ކޮމްޕްލެކްސް އެކުލެވޭ ހުރިހާ ސަބްޔުނިޓްތަކެއް އަޕްރެގްޔުލޭޓް ވެފައި ހުރެއެވެ (މި ކޮމްޕްލެކްސް އިން އޭގެ ފަހުން އުފެދޭ އަދި އޭގެ ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން އުފެދޭ ބީސީއޭއޭ ކާބަން ސްކެލެޓަންގެ ޑިކާރބޮކްސައިލޭޝަން ކެޓަލައިޒް ކުރެއެވެ) (ފޮޓޯ 3އޭ އަދި ފޮޓޯ S5A). ނަމަވެސް ސޯރޓް ކުރެވުނު ޕީއެން އިން ޚުދު ބީސީއޭއޭ އަށް ވެސް ފާހަގަކޮށްލެވޭ ބަދަލެއް ނުފެނުނުއިރު، މިއީ މި މުހިއްމު އެމިނޯ އެސިޑްތައް ސެލްތަކުން ނަގާ މިންވަރު އިތުރުވުމުން ނުވަތަ ޓީސީއޭ ސައިކަލް އިތުރުކުރުމަށް އެހެން މަސްދަރުތައް (ގްލޫކޯޒް ނުވަތަ ލެކްޓިކް އެސިޑް) ބޭނުންކުރުމުން ކަމަށް ވެދާނެއެވެ (ފޮޓޯ S5B). އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެން ތަކުން ވެސް އުމުރުން 8 ހަފްތާގައި ގްލޫޓާމިން ޑިކޮމްޕޮޒިޝަން އަދި ޓްރާންސްއެމިނޭޝަން އެކްޓިވިޓީސް އިތުރުވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވޭއިރު، މިކަން ފާހަގަކުރެވެނީ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެންޒައިމްސް ގްލޫޓާމިނޭޒް (ޖީއެލްއެސް) އަދި ގްލޫޓާމިން ޕައިރޫވޭޓް ޓްރާންސްއެމިނޭޒް 2 (ޖީޕީޓީ2) ގެ އަޕް ރެގިއުލޭޝަން އިންނެވެ (ފޮޓޯ 3، އޭ އަދި ސީ). ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ ޖީއެލްއެސްގެ އަޕް ރެގިއުލޭޝަން ސްޕްލައިސްޑް އައިސޯފޯމް ގްލޫޓާމިނޭޒް ސީ (ޖީއެލްއެސް-ޖީއޭސީ) އަށް ލިމިޓްވެފައިވާ ކަމެވެ (Mfn2cKO/CTRL ގެ ބަދަލަކީ ގާތްގަނޑަކަށް 4.5 ގުނަ، P = 0.05)، އަދި ކެންސަރުގެ ޓިޝޫތަކުގައި އޭގެ ވަކި އަޕް ރެގިއުލޭޝަން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ބަޔޯއެނަރޖީއަށް އެހީތެރިވެދެއެވެ. (27) އެވެ.
(އ) ހީޓް މެޕުން ފެންނަނީ 8 ހަފްތާގައި ކަނޑައެޅިފައިވާ މަގަށް ޕްރޮޓީން ލެވެލްއަށް އަންނަ ފޯލްޑް ބަދަލުވުމެވެ. (ބ) އެންޓި-ޕީސީއެކްސް އެންޓިބޮޑީ (ސްކޭލް ބާރ، 20 μm) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ސެރެބިލަރ ސްލައިސްއެއްގެ މިސާލު. ރީނދޫ ކުލައިގެ ތިރިން އިޝާރާތް ކުރަނީ ޕަރކިންޖޭ ސެލް ހަށިގަނޑަށެވެ. (ސ) އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އަށް މުހިންމު ކެންޑިޑޭޓެއްގެ ގޮތުގައި ދެނެގަނެވޭ ޓައިމް ކޯސް ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް (މަލްޓިޕަލް ޓީ-ޓެސްޓް، *އެފްޑީއާރު <5%؛ n = 3-5 މައިސް) އެވެ. (ޑ) މަތީގައި: [1-13C]ޕައިރޫވޭޓް ޓްރޭސަރ ގައި ހިމެނޭ ލޭބަލް ކުރެވިފައިވާ ކާބަން ވަންނަ ތަފާތު ގޮތްތައް (އެބަހީ، ޕީޑީއެޗް ނުވަތަ ޓްރާންސް-އާޓިރިއަލް ރޫޓް މެދުވެރިކޮށް) ދައްކުވައިދޭ ސްކީމެޓިކް ޑައިގްރާމެކެވެ. ތިރީގައި: ވައިއަލިން ޗާޓުން ފެންނަނީ [1-13C]ޕައިރޫވޭޓް (ޕެއަރޑް ޓީ-ޓެސްޓް؛ ** P <0.01) އިން ސީރިއަސް ސެރެބިލަރ ސްލައިސް ލޭބަލް ކުރުމަށްފަހު އެސްޕާޓިކް އެސިޑް، ސިޓްރިކް އެސިޑް އަދި މެލިކް އެސިޑަށް ބަދަލުވާ ސިންގަލް ލޭބަލް ކާބަން (M1) ގެ އިންސައްތައެވެ. (ށ) ދައްކާފައިވާ މަގުގެ ފުރިހަމަ ޓައިމް ހީސްޓްރީ ތަޙުލީލުކުރުން. ހަމައެކަނި 8 ހަފްތާގައި P<0.05 ހުންނަ ޕްރޮޓީންތަކަށް ބަލާށެވެ . ޑޭޝް ލައިން: އެޖަސްޓްމަންޓް ވެލިއުއެއް ނެތް (ޓޫ-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). ޑޭޓާ ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން±ސެމް ގެ ގޮތުގައެވެ.
އަޅުގަނޑުމެންގެ ތަޙުލީލުގައި ބީސީއޭއޭ ކެޓަބޮލިޒަމް ވެފައިވަނީ އަޕް ރެގިއުލޭޝަންގެ މުހިންމު އެއް މަގަކަށެވެ. މި ޙަޤީޤަތުން ވަރަށް ބޮޑަށް ދޭހަވަނީ އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެން ގައި ޓީސީއޭ ސައިކަލަށް ވަންނަ ވެންޓިލޭޝަން ވޮލިއުމް ބަދަލުވެދާނެ ކަމެވެ. މިއީ ނިއުރޯނަލް މެޓަބޮލިކް ރީވައިރިންގ ގެ ބޮޑު ގޮތެއް ތަމްސީލުކުރާ ކަމަކަށް ވެދާނެއެވެ. މި ހައިޕޮތެސިސްއާ އެއްގޮތަށް، އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނީ މައިގަނޑު އެންޓި-އެތެރޮސްކްލޮރޮޓިކް އެންޒައިމް ޕީސީއެކްސް އަޕް-ރެގިއުލޭޓް ވެފައިވާ (Mfn2cKO/CTRL ގާތްގަނޑަކަށް 1.5 ގުނަ ބަދަލުވާ؛ ފޮޓޯ 3އޭ)، މިއީ ޕައިރޫވޭޓް އޮކްސަލޯއެސިޓެޓަށް ބަދަލުވުމަށް ކެޓަލައިޒް ކުރާ އެއްޗެއް (28)، މިއީ ސިކުނޑީގެ ޓިޝޫގައި ކަމަށް ބެލެވޭ The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ނަތީޖާތަކާ އެއްގޮތަށް ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕީން ދައްކާ ގޮތުގައި އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެންތަކުގައި ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން ވަކިން އަދި ވަރަށް ބޮޑަށް އިތުރުވެފައިވާއިރު ޕީސީއެކްސް ރިއެކްޓިވިޓީ މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ހަނިވެފައިވަނީ ކޮންޓްރޯލްގެ ޖެހިގެން ހުންނަ ބާގްމަން ގްލިއަލް ސެލްތަކަށެވެ ( ފޮޓޯ 3ބީ ). ޕީސީއެކްސްގެ ފާހަގަކުރެވުނު އަޕްރެގްޔުލޭޝަން ފަންކްޝަނަލީ ޓެސްޓް ކުރުމަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން އެކިއުޓް ސެރެބިލަރ ސްލައިސްތަކަށް [1-13C]ޕައިރޫވޭޓް ޓްރޭސަރ އިން ފަރުވާ ދިނީމެވެ. ޕައިރޫވޭޓް ޕައިރޫވޭޓް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް (PDH) އިން އޮކްސިޑައިޒް ކުރިއިރު، އޭގެ އައިސޮޓޯޕް ލޭބަލް ނެތިގެން ދިޔައީ , އެކަމަކު ޕައިރޫވޭޓް ވެސްކިއުލަރ ރިއެކްޝަންތަކުގެ ސަބަބުން މެޓަބޮލައިޒް ވުމުން ޓީސީއޭ ސައިކަލް އިންޓަރމީޑިއޭޓްސް އަށް ވަދެއެވެ (ފޮޓޯ 3ޑީ). އަޅުގަނޑުމެންގެ ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާއަށް ތާއީދުކޮށް، މި ޓްރޭސަރ އިން Mfn2cKO ސްލައިސްތަކުގެ އެސްޕާޓިކް އެސިޑްގައި ގިނަ އަދަދެއްގެ މާކެރެއް ފެނިފައިވާއިރު، ސިޓްރިކް އެސިޑް އަދި މެލިކް އެސިޑް ވެސް މާބޮޑު ނޫން ނަމަވެސް މެދުމިނުގެ ޓްރެންޑެއް ފެނިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 3ޑީ).
މައިޓޯކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން ހުންނަ މައިޓޯޕާކް މަސްތަކުގެ ޑޮޕަމިން ނިއުރޯންތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޓްރާންސްކްރިޕްޝަން ފެކްޓަރ އޭ ޖީން (Tfam) ވަކިން ނައްތާލާ ނިއުރޯންތަކުގައި (ފޮޓޯ S6B) ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން ވެސް ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ވެފައިވެއެވެ (31). ހަށިގަނޑުގައި އޮކްސްފޯސް ހުރެއެވެ. ފާހަގަކޮށްލެވޭ ކަމަކީ އާޓިރިއޯސްކްލޮރޯސިސް އާއި ގުޅުންހުރި ނިއުރޯންތަކުގައި އެކްސްޕްރެސްވެދާނެ ޔުނިކް އެންޒައިމްތައް (32-34) ޕްރޮޕިއޮނައިލް-ކޯއޭ ކާރބޮކްސައިލޭޒް (PCC-A) ފަދަ އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެންތަކުގައި ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް-ރެގިއުލޭޓް ވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވިފައިވާއިރު، މެލޮނިލް-ކޯއޭ އިން ޕްރޮޕިއޮނައިލް-ކޯއޭ ސުކްސިނިލް-ކޯއޭ އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މެލިކް އެންޒައިމް 3 (ME3) އަށް ބަދަލުކުރެއެވެ. އޭގެ މައިގަނޑު ދައުރަކީ މެލެޓް އިން ޕައިރޫވޭޓް ހޯދުމެވެ (ފޮޓޯ 3، އޭ އަދި ސީ) (33، 35). މީގެ އިތުރުން ޕީޑީއެޗް ފޮސްފޮރައިލެޓްކޮށް މިހެންވުމުން އިންއެކްޓިވޭޓް ކުރާ ޕީޑީކޭ3 އެންޒައިމް މާބޮޑުތަނުން އިތުރުވެފައިވާކަން އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ( 36 ) ކަމަށާއި ޕީޑީއެޗް އެކްޓިވޭޓްކުރާ ޕީޑީޕީ1 އެންޒައިމް ނުވަތަ ޚުދު ޕީޑީއެޗް އެންޒައިމް ކޮމްޕްލެކްސް އަށް ބަދަލެއް އައިސްފައި ނުވާ ކަމަށެވެ ( ފޮޓޯ 3އޭ ). އެއްގޮތަކަށްވެސް Mern2cKO PNs ގައި Ser293 ގައިވާ PDH ކޮމްޕްލެކްސްގެ ޕައިރޫވޭޓް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް E1 ކޮމްޕޮނެންޓްގެ α1 ސަބްޔުނިޓް α (PDHE1α) ސަބްޔުނިޓްގެ ފޮސްފޮރައިލޭޝަން އިތުރުވެފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ S6C) ( ފޮޓޯ S6C ). ޕައިރޫވޭޓް އަށް ވެސްކިއުލަރ އެކްސެސްއެއް ނެތެވެ.
އެންމެ ފަހުން އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި ސެރީން އަދި ގްލައިސިން ބަޔޯސިންތެސިސްގެ ސުޕަރ ޕަތްވޭއާއި، ގުޅުންހުރި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފޮލޭޓް (1C) ސައިކަލް އަދި ޕްރޮލައިން ބަޔޯސިންތެސިސް (ފޮޓޯ 1ޖީ އަދި ފޮޓޯ S5C) މިހުރިހާ ކަމެއްވެސް ރިޕޯޓްތައް ބުނާގޮތުން ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ވެއެވެ. ވަށައިގެންވާ ޓިޝޫތައް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން އާއި އެކު އެކްޓިވޭޓް ވެއެވެ (5-7). މި ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާއަށް ތާއީދުކުރާ ކޮންފޯކަލް އެނަލިސިސްއިން ދައްކާ ގޮތުގައި އޮކްސްފޯސް ގެއްލިފައިވާ ޕީއެންގައި 8 ހަފްތާގެ މަސްތަކުގެ ސެރެބިލަރ ސްލައިސްތަކަށް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފޯލޭޓް ސައިކަލްގެ މުހިއްމު އެންޒައިމްއެއް ކަމަށްވާ ސެރީން ހައިޑްރޮކްސީމެތައިލްޓްރާންސްފެރޭޒް 2 (SHMT2) އަށް ފަރުވާ ދީފައިވެއެވެ. ދިފާޢީ ނިޒާމުގެ މުހިންމު ރައްދު (ފޮޓޯ S5D) . ސީޔޫ-ގްލޫކޯޒް އިންކިއުބޭޓް ކޮށްފައިވާ 13 އެކިއުޓް ސެރެބިލަރ ސްލައިސްގައި މެޓަބޮލިކް ޓްރޭސިންގ ތަޖުރިބާތަކުން ސެރިން އަދި ޕްރޮލައިން ބަޔޯސިންތެސިސްގެ އަޕް ރެގިއުލޭޝަން އިތުރަށް ކަށަވަރުވެ، ސެރިން އަދި ޕްރޮލައިން އަށް ކާބަން އައިސޯފޯމްސް ފްލަކްސް އިތުރުވާކަން ހާމަވެއެވެ (ފޮޓޯ S5E). ޖީއެލްއެސް އަދި ޖީޕީޓީ2 އިން ޕްރޮމޯޓްކުރާ ރިއެކްޝަންތަކަކީ ގްލޫޓާމިން އިން ގްލޫޓާމޭޓް ސިންތެސިސް ވުމާއި ގްލޫޓާމޭޓް އަދި α-ކެޓޯގްލޫޓޭރޭޓް އާއި ދެމެދު ޓްރާންސްއެމިނޭޝަން އަށް ޒިންމާވާ ރިއެކްޝަންތަކަކަށް ވާތީ، އެމީހުންގެ އަޕްރެގްޔުލޭޝަން އިން ދައްކާ ގޮތުގައި OXPHOS-deficient neurons have an increased demand for glutamate , މިއީ ޕްރޮލައިންގެ ބަޔޯސިންތެސިސް އިތުރުވުން ދެމެހެއްޓުމަށް އަމާޒު ހިފާފައިވާ ކަމެއް ކަމަށް ވެދާނެއެވެ (ފޮޓޯ S5C). މި ބަދަލުތަކާ ހިލާފަށް ޕީއެން އަށް ޚާއްޞަ Mfn2cKO މަސްތަކުން ސެރެބިލަރ އެސްޓްރޯސައިޓްތަކުގެ ޕްރޮޓީއޮމިކް އެނަލިސިސް އިން ދައްކާ ގޮތުގައި މި މަގުތަކަށް (ހުރިހާ އެންޓިޕެރޮކްސިޑޭޒްތައް ހިމެނޭގޮތަށް) އެކްސްޕްރެޝަންގައި މާބޮޑު ބަދަލެއް ނާދެއެވެ.
ޚުލާޞާކޮށް ދަންނަވާނަމަ، މި ތަޙުލީލުތަކުން ޕީއެންތަކުގައި ވަކި މެޓަބޮލިކް މަގުތައް ޓެމްޕަރަލް އެކްޓިވޭޝަންގެ ތަފާތު ގޮތްތައް ފާހަގަކުރެވުނެވެ. އާދަޔާ ހިލާފު ނިއުރޯނަލް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފަންކްޝަންގެ ސަބަބުން އަވަސް އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އަދި 1C ރިމޯޑެލިންގ (ފޮޓޯ 3E އަދި ފޮޓޯ S5C)، އަދި އައި އަދި އައިވީ ކޮމްޕްލެކްސްތަކުގެ އެކްސްޕްރެޝަނަށް ލަފާކުރެވޭ ބަދަލުތައް ވެސް ކުރިމަތިވި ނަމަވެސް، ސެރިން ޑީ ނޮވޯ ސިންތެސިސްއަށް އަންނަ ބަދަލުތަކަކީ ހަމައެކަނި އެއީ ހަމައެކަނި ފަހު މަރުހަލާތަކުގައި ފާހަގަކުރެވުނު ބަދަލުތަކެކެވެ. އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަން (ފޮޓޯ 3އީ އަދި ފޮޓޯ S5C) . މި ހޯދުންތަކުން ކަނޑައަޅާފައިވަނީ ސްޓްރެސް އިންޑައުސްޑް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް (1C ސައިކަލް) އަދި ސައިޓޯޕްލާސްމިކް (ސެރިން ބަޔޯސިންތެސިސް) އިން ޓީސީއޭ ސައިކަލްގައި އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އިތުރުވުމާ ގުޅިގެން ނިއުރޯނަލް މެޓަބޮލިޒަމް އަލުން ބައްޓަން ކުރާ ސިކުއެންޝަލް ޕްރޮސެސްއެކެވެ.
8 ހަފްތާގެ އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެން ތަކުގައި ހައި ފްރީކުއެންސީ އެކްސައިޓޭޝަން އެކްޓިވިޓީ ދަމަހައްޓައި، މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން ފޫބައްދަން މެޓަބޮލިކް ރީކަނެކްޝަން ބޮޑުވެދާނެ އެވެ. މި ހޯދުމުން ޝައުގުވެރި ފުރުސަތެއް އުފެދެނީ މިވަގުތުވެސް މި ސެލްތަކަށް ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަން ލަސްކުރުމަށް ނުވަތަ ހުއްޓުވުމަށް ފަރުވާގެ އިންޓަރވެންޝަން ލިބިދާނެ ކަމެވެ. ލަހުން. އަޅުގަނޑުމެން މި ފުރުޞަތު ހައްލުކުރީ މިނިވަން ދެ އިންޓަރވެންޝަނެއްގެ ތެރެއިން. ފުރަތަމަ ގޮތުގައި އަޅުގަނޑުމެން ޑިޒައިންކުރީ Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) ވެކްޓަރ އެއް އިން ވިވޯ ގައި OXPHOS ނެތް PN ތަކުގައި MFN2 ސެލެކްޓިވްކޮށް އެކްސްޕްރެސް ކުރެވޭނެ ގޮތަށެވެ ( ފޮޓޯ S7A ). MFN2 އިންކޯޑްކުރާ އޭއޭވީ އާއި ފްލޫރެސްސެންޓް ރިޕޯޓަރ ޖީން mCherry (Mfn2-AAV) އިން ވިޓްރޯގައި ޕްރައިމަރީ ނިއުރޯން ކަލްޗަރތަކުގައި ޔަގީންކޮށް، MFN2 Cre އަށް ޑިޕެންޑް ގޮތެއްގައި އެކްސްޕްރެސްވެ، މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މޯރފޮލޮޖީ ސަލާމަތްކޮށް، Mfn2cKO ނިއުރޯންތަކުގައި ނިއުރޯމިއުޓޭޝަން ހުއްޓުވިއެވެ ( ފޮޓޯ S7، B، D އަދި E ). ދެން އަޅުގަނޑުމެން އިން ވިވޯ އެކްސްޕެރިމެންޓްތައް ކޮށްގެން 8 ހަފްތާގެ Mfn2-AAV ސްޓިރިއޯޓެކްޓިކަލީ Mfn2cKO އަދި ކޮންޓްރޯލް މަސްތަކުގެ ސެރެބިލަރ ކޮޓަކްސްއަށް ފޯރުކޮށްދީ، 12 ހަފްތާގެ މަސްތައް ތަޙުލީލުކުރިން ( ފޮޓޯ 4އޭ ). ފަރުވާ ދިން Mfn2cKO މަސްތައް މަރުވިއެވެ (ފޮޓޯ 1، އޭ އަދި ބީ) (16). އިން ވިވޯގައި ވައިރަލް ޓްރާންސްޑަކްޝަންގެ ސަބަބުން ބައެއް ސެރެބިލަރ ސަރކަލްތަކުގައި ޕީއެން ސެލެކްޓިވް އެކްސްޕްރެޝަން އުފެދިފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ S7، G އަދި H ). ހަމައެކަނި mCherry (Ctrl-AAV) އެކްސްޕްރެސް ކުރާ ކޮންޓްރޯލް އޭއޭވީ އިންޖެކްޝަން ކުރުމުން Mfn2cKO ޖަނަވާރުތަކުގައި ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަންގެ މިންވަރަށް މާބޮޑު އަސަރެއް ނުކުރިއެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް Mfn2-AAV އިން ޓްރާންސްޑޫސް ކުރެވިފައިވާ Mfn2cKO ތަކުގެ ތަޙުލީލުތަކުން ޕީއެން ސެލް ލޭޔަރ ގެ ރައްކާތެރިކަމުގެ ބޮޑު އަސަރެއް ފެނިފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 4، ބީ އަދި ސީ ). ޚާއްޞަކޮށް ނިއުރޯން ޑެންސިޓީ ކޮންޓްރޯލް ޖަނަވާރުތަކާ ގާތްގަނޑަކަށް ތަފާތު ނުކުރެވޭހެން ހީވެއެވެ (ފޮޓޯ 4، ބީ އަދި ސީ، އަދި ފޮޓޯ އެސް7، އެޗް އަދި އައި). MFN1 ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ނަމަވެސް MFN2 ގެ އެކްސްޕްރެޝަން އަކީ ނިއުރޯނަލް މަރު ސަލާމަތްކުރުމުގައި ހަމަ އެހާމެ ފައިދާހުރި ކަމެއް ( ފޮޓޯ 4C އަދި ފޮޓޯ S7، C އަދި F) ކަމަށާއި، މިކަމުން ދޭހަވަނީ އެކްޓޮޕިކް MFN1 ގެ އެކްސްޕްރެޝަނަކީ MFN2 ގެ މަދުކަން ފައިދާހުރި ގޮތެއްގައި އިތުރުކުރެވޭނެ ކަމެއް ކަމަށެވެ. އެއް ޕީއެން ލެވެލްގައި އިތުރު ތަޙުލީލުތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި Mfn2-AAV އިން މައިޓޮކޮންޑްރިއާގެ އަލްޓްރާސްޓްރަކްޗަރ ބޮޑުތަނުން ސަލާމަތްކޮށް، mtDNA ލެވެލް ނޯމަލައިޒްކޮށް، އެންޓި-އެންޖިއޯޖެނެސިސް މާކެރ PCx ގެ މަތީ އެކްސްޕްރެޝަން ރިވަރސް ކޮށްދެއެވެ (ފޮޓޯ 4، C އިން E). ސަލާމަތް ކުރެވުނު Mfn2cKO މަސްތައް އަރާމު ޙާލަތުގައި ލޮލުން ބަލާލުމުން އެމީހުންގެ ޕޯސްޗަރ އާއި މޮޓޯ ސިމްޕްޓޮމްސް (މޫވްމަންޓް S1 އިން S3 އަށް) ރަނގަޅުވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ. ނިންމާލަމުން މި ތަޖުރިބާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އޮކްސްފޯސް ވަރަށް ބޮޑަށް މަދު ޕީއެން އަށް އެމްއެފްއެން2 އަލުން ލަސްވުމަކީ އެމްޓީޑީއެންއޭ ބޭނުންކުރުން ފަހަތަށް ޖެހި އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އުފެއްދުމަށް ފުދޭ ކަމެކެވެ.
(އ) ދައްކާފައިވާ މެޓަބޮލިކް މަގު އެކްޓިވޭޓް ވުމުން އެމްއެފްއެން2 އިންކޯޑްކުރާ އޭއޭވީ އިންޖެކްޓް ކުރުމުގެ ތަޖުރިބާގެ ޝެޑިއުލް ދައްކުވައިދޭ ސްކީމެކެވެ. (ބ) 8 ހަފްތާގައި Mfn2cKO މަސްތަކުން ޓްރާންސްޑޫސްކޮށް އެންޓި-ކެލްބިންޑިން އެންޓިބޮޑީ އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ 12 ހަފްތާގެ ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންތަކުގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ކޮންފޯކަލް ފޮޓޯގްރާފްސް. ކަނާތްފަރާތުގައި: އެކްސަން ފައިބަރުތަކުގެ ސްކޭލިންގ. އެކްސަން ޒޫމްގެ ސްކޭލް އަކީ 450 އަދި 75 μm އެވެ. (ސ) ކަނާތް: އޭއޭވީ ޓްރާންސްޑަކްޝަން ލޫޕް (އޭއޭވީ+) ގައި ޕަރކިންޖޭ ސެލް ޑެންސިޓީ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ކަނޑައެޅުން (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ n = 3 މައިސް). ކަނާތް: 12 ވަނަ ހަފްތާގައި ޓްރާންސްޑޫސްޑް ޕީއެންގައި އެމްޓީޑީއެންއޭ ފޯކަސް އެނަލިސިސް (އަންޕެއަރޑް ޓީ-ޓެސްޓް؛ n = 6 ސެލްސް ފްރޮމް ތިން މައިސް) . * ޕީ <0.05؛ ** ޕީ <0.01. (ޑ) ދައްކާފައިވާ ވައިރަލް ވެކްޓަރސް އިން ޓްރާންސްޑޫސް ކުރެވިފައިވާ Mfn2cKO ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންތަކުގެ ޕީއެންތަކުގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ޓްރާންސްމިޝަން އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯގްރާފްސް. ޕިންކް ކުލައިގެ މާސްކުން ޑެންޑްރައިޓްސް އިން ހިފާފައިވާ ސަރަހައްދު ދައްކުވައިދޭއިރު، ރީނދޫ ކުލައިގެ ޑޮޓް ޖަހާފައިވާ ސްކުއަރ އިން ދައްކުވައިދެނީ ކަނާތްފަރާތުގައި ދީފައިވާ ޒޫމް އެވެ؛ n ތަމްސީލުކުރަނީ ނިއުކްލިއަސް އެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 1μm. (އީ) އިން ފެންނަނީ 12 ހަފްތާގައި ޓްރާންސްޑޫސް ކުރެވޭ ޕީއެން ގައި ޕީސީއެކްސް ސްޓޭނިންގ ގެ މިސާލެކެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 20μm. އޯއީ، އޯވަރއެކްސްޕްރެޝަން؛ އެފްސީ، ފޯލްޑް ބަދަލުކުރުން.
އެންމެ ފަހުން އަޅުގަނޑުމެން ތަހުގީގުކުރީ އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަން ތަޖުރިބާކޮށްފައިވާ ޕީއެންތަކުގައި ޕެރޮކްސިޑޭޒް އިންޑައުސްޑް ސެލް ސަރވައިވަލްގެ މުހިންމުކަމެވެ. އަހަރެމެން ވަކިން ޚާއްޞަކޮށް މައުސް ޕީސީއެކްސް އެމްއާރްއެންއޭ (AAV-shPCx) އަށް އަމާޒުކޮށްގެން އޭއޭވީ-އެސްއެޗްއާރްއެންއޭ (ކުރު ހެއާޕިން އާރްއެންއޭ) އިންކޯޑްކުރާ mCherry އުފައްދައި، ވައިރަސް ނުވަތަ އޭގެ ސްކްރެމްބްލްޑް ކޮންޓްރޯލް (AAV-scr) Mfn2cKO މަސްތަކުގެ ސެރެބެލަމް އަށް އިންޖެކްޓް ކުރިން. ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން އިތުރުވެ (ފޮޓޯ 3ސީ) އަދި ޕީއެން ސެލް ލޭޔަރ އަދިވެސް ރަނގަޅަށް ހުރި ދުވަސްވަރު ޕީސީއެކްސް ނޮކްޑައުން އަށް ފައިދާހުރި ގޮތެއްގައި (ފޮޓޯ 5އޭ) އިންޖެކްޝަން ދިނެވެ (ފޮޓޯ 1އޭ). ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ ޕީސީއެކްސް (ފޮޓޯ S8A) ވައްޓާލުމުން ޕީއެން މަރުވުން ވަރަށް ބޮޑަށް އަވަސްވެ، މިއީ އިންފެކްޝަންގެ ހަމައެކަނި ހަނި އަނގޮޓި (ފޮޓޯ 5، ބީ އަދި ސީ) އެވެ. ޕީސީއެކްސް އަޕް-ރެގިއުލޭޝަން އިންޑައުސް ކުރާ މެޓަބޮލިކް އިފެކްޓްސްގެ މެކޭނިޒަމް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި، ޕީސީއެކްސް ނޮކްޑައުން އަށް ފަހު ޕީއެންސް ގެ ރެޑޮކްސް ސްޓޭޓަސް އަދި އޭއޭވީ މެދުވެރިކޮށް އޮޕްޓިކަލް ބަޔޯސެންސަރ Grx1-roGFP2 އެއްފަހަރާ އެކްސްޕްރެސް ކުރުމުން (ފޮޓޯ S8، B އިން D) ގްލޫޓާތީއޯން ވަޒަންކުރީ ޕެޕްޓައިޑް ރެޑޮކްސް ޕޮޓެންޝަލްގެ ނިސްބަތުން ބަދަލު (38) އެވެ. ދެން، އެފްއެލްއައިއެމް ކޮންޑިޝަންސް ޔަގީންކުރުމަށްފަހު ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ރެޑޮކްސް ސްޓޭޓަސްއަށް އަންނަ ބަދަލުތައް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި 7 ހަފްތާގެ Mfn2cKO ނުވަތަ ކޮންޓްރޯލް ލިޓަރމެޓްސްގެ އެކިއުޓް ބްރެއިން ސްލައިސްތަކުގައި ޓޫ-ފޮޓޯން ފްލޫރެސެންސް ލައިފްޓައިމް އިމޭޖިންގ މައިކްރޮސްކޯޕީ (FLIM) ކުރިއަށް ގެންދިޔައީމެވެ (ފޮޓޯ S8، E އިން G). މި ތަޙުލީލުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން ނެތް އެއް Mfn2cKO PN އެއްގެ އޮކްސިޑޭޝަން ސްޓޭޓް ވަރަށް ބޮޑަށް އިތުރުވެފައިވާއިރު، މިއީ ކޮންޓްރޯލް ނިއުރޯން ނުވަތަ ހަމައެކަނި ސްކްރެމްބްލްޑް shRNA އެކްސްޕްރެސް ކުރާ Mfn2cKO PN ތަކާ ތަފާތު ކަމެކެވެ ( ފޮޓޯ 5، ޑީ އަދި އީ ). ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން ޑައުން ރެގިއުލޭޓް ކުރިއިރު، ވަރަށް އޮކްސިޑައިޒްޑް ސްޓޭޓް ދައްކާ Mfn2cKO ޕީއެންސްގެ އިންސައްތަ ތިންގުނައަށް ވުރެ އިތުރުވެ ( ފޮޓޯ 5E ) ޕީސީއެކްސް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ކުރުމުން ޑިޖެނެރޭޓް ނިއުރޯންތަކުގެ ރެޑޮކްސް ކެޕޭސިޓީ ދަމަހައްޓާކަން ހާމަވެއެވެ.
(އ) ދައްކާފައިވާ މެޓަބޮލިކް މަގު އެކްޓިވޭޓް ވުމުން shPCx އިންކޯޑްކުރާ އޭއޭވީ އިންޖެކްޓް ކުރުމުގެ ތަޖުރިބާގެ ޝެޑިއުލް ދައްކުވައިދޭ ސްކީމެކެވެ. (ބ) 4 ހަފްތާގައި ޓްރާންސްޑޫސްކޮށް އެންޓި-ކެލްސިނިއުރިން އެންޓިބޮޑީ އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ Mfn2cKO މަސްތަކުގައި 8 ހަފްތާގެ ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންތަކުގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ކޮންފޯކަލް ފޮޓޯގްރާފްސް. ސްކޭލް ބާރ، 450μm. (ސ) އޭއޭވީ ޓްރާންސްޑޫސްޑް ލޫޕްތަކުގައި ޕަރކިންޖޭ ސެލް ޑެންސިޓީ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ކަނޑައެޅުން (ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް؛ n = 3 އިން 4 މައިސް) . ޑޭޓާ ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން±ސެމް ގެ ގޮތުގައެވެ؛ ***ޕީ<0.001. (ޑީ) ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް އެފްއެލްއައިއެމް ތަސްވީރުން ފެންނަނީ ކަނޑައެޅިފައިވާ ތަޖުރިބާ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން ގްލޫޓާތީއޯން ރެޑޮކްސް ސެންސަރ Grx1-roGFP2 އެކްސްޕްރެސްކުރާ 7 ހަފްތާގެ ޕީއެންގެ އެވްރެޖް ލައިފް ސްޕަން އެވެ. އެލްޔޫޓީ (ލޫކް-އަޕް ޓޭބަލް) ރޭޝިއޯ: ސަރވައިވް ޓައިމް އިންޓަވަލް (ޕައިކޯސެކަންޑްގައި) އެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 25μm. (އީ) ހިސްޓޯގްރާމް އިން ފެންނަނީ (D) އިން ފެށިގެން Grx1-roGFP2 ލައިފްޓައިމް ވެލިއުތައް ބެހިފައިވާ ގޮތެވެ (ކޮންމެ ހާލަތެއްގައި ދެ މަސްއެއްގައި n=158 އިން 368 ސެލްސް). ކޮންމެ ހިސްޓޯގްރާމެއްގެ މަތީގައިވާ ޕައި ޗާޓް: ދައްކުވައިދެނީ ސީޓީއާރުއެލް-އޭއޭވީ-ސްކްއާރ ގައި އެވްރެޖް ލައިފްސްޕަން ވެލިއުގެ 1 އެސްޑީއަށްވުރެ މާ ދިގު (ރަތް، އޮކްސިޑައިޒްޑް) ނުވަތަ ކުރު (ނުވަތަ ކަޅު، ކުޑަ) ލައިފްސްޕަން ވެލިއުތަކެއް ހުންނަ ސެލްތަކުގެ އަދަދެވެ. (އެފް) ހުށަހަޅާފައިވާ މޮޑެލްއިން ފެންނަނީ ނިއުރޯނަލް ޕީސީއެކްސް އަޕްރެގްޔުލޭޝަންގެ ޕްރޮޓެކްޓިވް އެފެކްޓެވެ.
އެއްކޮށް ބަލާއިރު މިތަނުގައި އަޅުގަނޑުމެން ފޯރުކޮށްދޭ ޑޭޓާއިން ދައްކާ ގޮތުގައި އެމްއެފްއެން2 ރީ އެކްސްޕްރެޝަން ކުރުމުން ސީރިއަސް އޮކްސްފޯސް ޑެފިޝަންސީ، ސީރިއަސް އެމްޓީޑީއެންއޭ ޑިޕްލީޝަން، އަދި އިންތިހާއަށް އާދަޔާ ހިލާފު އިސްޓާ ކަހަލަ މޯރފޮލޮޖީ އާއި އެކު ކުރިއަރާފައިވާ ޕީއެން މުޅިން ސަލާމަތް ކުރެވޭނެއެވެ. ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަންގެ ސަބަބުން ސެލް މަރުވުމުގެ ކުރިން އޮންނަ މަރުހަލާގެ ރިވަރސިބަލް ހެކި ލިބެއެވެ. މެޓަބޮލިކް ފްލެކްސިބިލިޓީގެ މި މިންވަރަށް އިތުރަށް ބާރުއަޅަނީ ނިއުރޯންތަކުން އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް (ޓީސީއޭ ސައިކަލްގެ ރީވައިރިންގ) އުފެއްދުމުގެ ޤާބިލުކަމުން، މިއީ އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެންތަކުގައި ޕީސީއެކްސް އެކްސްޕްރެޝަން ހުއްޓުވައި، ސެލް މަރުވުން އިތުރުކޮށްދޭ ކަމެކެވެ (ފޮޓޯ 5އެފް).
މި ދިރާސާގައި އަޅުގަނޑުމެން ހެކި ފޯރުކޮށްދިނީ، އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަނަށް ޕީއެން ތަކުގެ ޖަވާބަކީ މެޓަބޮލިކް ޕްރޮގްރާމްތަކުން އެކްޓިވޭޓް ކުރާ ޑިފެރެންޝަލް އެކްޓިވޭޝަން މަގު މެދުވެރިކޮށް މަޑުމަޑުން ޓީސީއޭ ސައިކަލް އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އަށް ކޮންވަރޖް ވުމެވެ. އަޅުގަނޑުމެން ޕްރޮޓީއޮމިކް އެނަލިސިސް ގިނަ ކޮމްޕްލިމެންޓަރީ މެތޯޑްތަކުން ކޮންފަރމްކޮށް، ސީރިއަސް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ސަބަބުން ގޮންޖެހުން ކުރިމަތިވުމުން ނިއުރޯންތަކުގައި ކުރިން ނޭނގޭ މެޓަބޮލިކް އިލެސްޓިސިޓީގެ ގޮތެއް ހުންނަކަން ހާމަވިއެވެ. އަޅުގަނޑުމެން ހައިރާންވި ކަމަކީ މުޅި ރީވައިރިންގ ޕްރޮސެސް ކޮންމެހެން ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަނާއެކު މަޑުމަޑުން އަދި ފަހަތަށް ނުޖެހޭ ގޮތަށް ޓާރމިނަލް މެޓަބޮލިކް ސްޓޭޓް ފާހަގަ ނުކުރެވުނު ނަމަވެސް އަޅުގަނޑުމެންގެ ޑޭޓާއިން ދައްކާ ގޮތުގައި ސެލް މަރުވުމުގެ ކުރިން މަރުހަލާގައި ވެސް މެއިންޓެނަންސް ނިއުރޯން އެއް އުފެދިދާނެއެވެ. މި ހޯދުން ދައްކާ ގޮތުގައި ނިއުރޯންތަކުގައި ހަށިގަނޑުގައި މެޓަބޮލިކް ޕްލާސްޓިސިޓީގެ ބޮޑު މިންވަރެއް ހުރެއެވެ. މި ޙަޤީޤަތުން ސާބިތުވާ ގޮތުގައި ފަހުން އެމްއެފްއެން2 އަލުން ތަޢާރަފްވުމަކީ ކީ މެޓަބޮލިކް މާކެރުގެ އެކްސްޕްރެޝަން ރިވަރސްކޮށް، ޕީއެން ޑިޖެނެރޭޝަން ހުއްޓުވޭނެ ކަމެކެވެ. އެއާ ޚިލާފަށް އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް ހުއްޓުވައި ނާރުތައް އަވަސްކޮށްދެއެވެ. ޓްރާންސްސެކްޝަނަލް އެވެ.
އަޅުގަނޑުމެންގެ ދިރާސާއިން އެންމެ ޝައުގުވެރިވާ އެއް ހޯދުންތަކަކީ އޮކްސްފޯސް ނެތް ޕީއެން ތަކުން ވަކިން ޚާއްޞަކޮށް އާޓިރިއޯސްކްލޮރޯސިސް ސްޓިމިއުލޭޓް ކުރާ އެންޒައިމްތައް އަޕް ރެގިއުލޭޓްކޮށްގެން ޓީސީއޭ ސައިކަލް މެޓަބޮލިޒަމް ބަދަލުކުރެވޭނެ ކަމެވެ. މެޓަބޮލިކް ރީއެރެންޖްމަންޓަކީ ކެންސަރު ސެލްތަކުގެ އާންމު ސިފައެއް ކަމަށާއި، އޭގެ ތެރެއިން ބައެއް ސެލްތައް ރިޑަކްޝަން އިކުއިވެންޓްސް އުފެއްދުމަށްޓަކައި ޓީސީއޭ ސައިކަލް އިންޓަރމީޑިއޭޓްސް ސަޕްލިމެންޓް ކުރުމަށް ގްލޫޓާމިން އަށް ބަރޯސާވާއިރު، މިއީ ނޭވާލާ ޗޭން ދުއްވާ އަދި ލިޕިޑް އަދި ނިއުކްލިއޯޓައިޑް ބަޔޯސިންތެސިސް ޕްރިކަސަރސް އުފެއްދުން ދެމެހެއްޓުމެވެ (39 , 40). ދާދިފަހުން ކުރެވުނު ދިރާސާއަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އޮކްސްފޯސް ޑިސްފެންޝަން ތަޖުރިބާކުރާ ޕެރިފެރަލް ޓިޝޫތަކުގައި ގްލޫޓާމިން/ގްލޫޓާމޭޓް މެޓަބޮލިޒަމް އަލުން ގުޅުވުމަކީ ވެސް ފާހަގަކޮށްލެވޭ ސިފައެކެވެ (5، 41)، މިތަނުގައި ގްލޫޓާމިން ޓީސީއޭ ސައިކަލަށް ވަންނަ މިސްރާބު ބިނާވެފައިވަނީ އޮކްސްފޯސް އިންޖަރީގެ ސީރިއަސްކަމުގެ ސަބަބުންނެވެ (41). ). ނަމަވެސް ހަށިގަނޑުގައި ހުންނަ ނިއުރޯނަލް މެޓަބޮލިކް ޕްލާސްޓިސިޓީ އާއި ބަލީގެ ކޮންޓެކްސްޓްގައި އޭގެ ގުޅުން ހުރެދާނެ ކަމުގެ ސާފު ހެއްކެއް ނެތެވެ. ދާދިފަހުން އިން ވިޓްރޯ ދިރާސާއަކުން ދައްކާފައިވާ ގޮތުގައި ޕްރައިމަރީ ކޯޓިކަލް ނިއުރޯންތަކުން ނިއުރޯޓްރާންސްމިޝަން އަށް ގްލޫޓާމޭޓް ޕޫލްތައް މޮބިލައިޒްކޮށް، މެޓަބޮލިކް ސްޓްރެސް ޝަރުތުތަކުގައި އޮކްސިޑޭޓިވް މެޓަބޮލިޒަމް އަދި އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް ކުރިއަރުވައެވެ ( 42 ). ފާހަގަކޮށްލެވޭ ކަމަކީ ޓީސީއޭ ސައިކަލް އެންޒައިމް ސުކްސިނެޓް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް ގެ ފާމަކޯލޮޖިކަލް އިންހިބިޝަންގެ ދަށުން ޕައިރޫވޭޓް ކާބޮކްސައިލޭޝަން އިން ކަލްޗަރޑް ސެރެބިލަރ ގްރެނިއުލް ނިއުރޯންތަކުގައި އޮކްސަލޯއެސިޓެޓް ސިންތެސިސް ދެމެހެއްޓޭނެ ކަމަށް ބެލެވެއެވެ ( 34 ). ނަމަވެސް މި މެކޭނިޒަމްތަކުގެ ފިޒިއޮލޮޖިކަލް ރިލެވަންސް ސިކުނޑީގެ ޓިޝޫތަކާ (އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި އެސްޓްރޯސައިޓްސް އަށް ނިސްބަތްވާ ކަމަށް ބެލެވޭ) އަދިވެސް މުހިންމު ފިޒިއޮލޮޖިކަލް މުހިންމުކަމެއް އެބައޮތެވެ ( 43 ). މި ހާލަތުގައި އަޅުގަނޑުމެންގެ ޑޭޓާއިން ދައްކާގޮތުގައި ހަށިގަނޑުގައި އޮކްސްފޯސް އިން ހަލާކުވާ ޕީއެންތައް ބީސީއޭއޭ ޑިގްރެޑޭޝަން އަދި ޕައިރޫވޭޓް ކާބޮކްސައިލޭޝަނަށް ބަދަލުކުރެވިދާނެ ކަމަށާއި މިއީ ޓީސީއޭ ޕޫލް އިންޓަރމީޑިއޭޓްސް ސަޕްލިމެންޓް ކުރުމުގެ މައިގަނޑު ދެ މަސްދަރެވެ. ނިއުރޯނަލް އެނާޖީ މެޓަބޮލިޒަމްއަށް ބީސީއޭއޭ ކެޓަބޮލިޒަމްގެ ޕުޓޭޓިވް ކޮންޓްރިބިއުޝަން ހުށަހަޅާފައިވީނަމަވެސް، ނިއުރޯޓްރާންސްމިޝަނަށް ގްލޫޓާމޭޓް އަދި ޖީއޭބީއޭގެ ދައުރުގެ އިތުރުން ( 44 ) އިން ވިވޯގައި މި މެކޭނިޒަމްތަކުގެ އެއްވެސް ހެއްކެއް އަދިވެސް ނެތެވެ. އެހެންކަމުން ޑިސްފެންޝަނަލް ޕީއެން ތަކުން އެތެރޮސްކްލޮރޯސިސް އިތުރުކޮށްގެން އެސިމިލޭޝަން ޕްރޮސެސް އިން ދުއްވާ ޓީސީއޭ އިންޓަރމީޑިއޭޓްސް ބޭނުންކުރުމުން އޮޓޮމެޓިކުން ފޫބައްދަން ފަސޭހަވެއެވެ. ޚާއްޞަކޮށް، މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން ހުންނަ ޕްރޮލިފަރޭޓިންގ ސެލްތަކުގައި ދައްކާފައިވާ އެސްޕާޓިކް އެސިޑްގެ ޑިމާންޑް އިތުރުވުން ދެމެހެއްޓުމަށް ޕީސީއެކްސް އަޕްރެގްޔުލޭޝަން ބޭނުންވެދާނެއެވެ ( 45 ). ނަމަވެސް އަޅުގަނޑުމެންގެ މެޓަބޮލޮމިކްސް އެނަލިސިސް އިން Mfn2cKO PNs (ފޮޓޯ S6A) ގައި އެސްޕާޓިކް އެސިޑްގެ ސްޓޭޑި-ސްޓޭޓް ލެވެލް އަށް މާބޮޑު ބަދަލެއް އައިސްފައެއް ނުވެއެވެ. އިން ވިވޯގައި ޑިސްފެންޝަނަލް ނިއުރޯންތަކުގައި ޕީސީއެކްސް އަޕްރެގްޔުލޭޝަންގެ ސީދާ މެކޭނިޒަމް ސިފަކުރެވިފައިވީނަމަވެސް، މި ޕްރީމެޗަރ ރިސްޕޮންސް ނިއުރޯންތަކުގެ ރެޑޮކްސް ސްޓޭޓް ދެމެހެއްޓުމުގައި މުހިންމު ދައުރެއް އަދާކުރާކަން އަޅުގަނޑުމެން ދައްކާލީމެވެ. ޚާއްޞަކޮށް ޕީއެންސް ތަކުން ޕީސީއެކްސް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ނުކުރުމަކީ އިތުރަށް އޮކްސިޑައިޒް ވެފައިވާ ޙާލަތަކަށް ގޮސް ސެލް މަރުވުން އަވަސްކޮށްދޭ ކަމެކެވެ. ބީސީއޭއޭ ޑިގްރެޑޭޝަން އެކްޓިވޭޓް ވުމާއި ޕައިރޫވޭޓް ކާރބޮކްސައިލޭޝަން ވުމަކީ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ޕެރިފެރަލް ޓިޝޫތައް ސިފަކުރެވޭނެ ގޮތްތަކެއް ނޫނެވެ (7). އެހެންކަމުން އެއީ ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަނަށް މުހިންމު ހަމައެކަނި ސިފައެއް ނޫން ނަމަވެސް އޮކްސްފޯސް ނެތް ނިއުރޯންތަކުގެ އިސްކަންދޭ ސިފައެއް ކަމަށް ފެނެއެވެ. .
ސެރެބިލަރ ޑިޒީޒް އަކީ އާންމުކޮށް އެޓޭކްސިއާގެ ގޮތުގައި ފާޅުވާ ހެޓަރޮޖީނިއަސް ވައްތަރެއްގެ ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޓިވް ބައްޔެކެވެ ( 46 ). މި ނިއުރޯން ޕޮޕިއުލޭޝަން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަނަށް ޚާއްޞަކޮށް ނާޒުކުވަނީ މަސްތަކުގައި އެމީހުންގެ ސެލެކްޓިވް ޑިޖެނެރޭޝަން އިންސާނާގެ ސްޕައިނޯސެރެބިލަރ އެޓޭކްސިއާ ސިފަވާ ގިނަ މޮޓޯ އަލާމާތްތައް އުފެއްދުމަށް ފުދޭތީއެވެ ( 16 , 47 , 48 ). ރިޕޯޓްތައް ބުނާގޮތުން މޫޓޭންޓް ޖީނެއް ހުންނަ ޓްރާންސްޖެނިކް މައުސް މޮޑެލް އަކީ އިންސާނާގެ ސްޕައިނޯސެރެބިލަރ އެޓޭކްސިއާ އާއި ގުޅިފައިވާ އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަން ހުންނަ މޮޑެލް ( 49 , 50 ) ކަމަށާއި ޕީއެންޕީއެޗްގައި އޮކްސްފޯސް މަދުވުމުގެ ނަތީޖާ ދިރާސާކުރުމުގެ މުހިންމުކަމަށް ބާރުއަޅާ ކަމަށެވެ. އެހެންކަމުން ޚާއްޞަކޮށް މި ޚާއްޞަ ނިއުރޯން ޕޮޕިއުލޭޝަން ފައިދާހުރި ގޮތެއްގައި އެކަހެރިކޮށް ދިރާސާކުރުމަކީ އެކަށީގެންވާ ކަމެކެވެ. ނަމަވެސް ޕީއެންތަކަކީ ޕްރެޝަރަށް ވަރަށް ނާޒުކު އަދި މުޅި ސެރެބިލަރ ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންގެ ދަށް ނިސްބަތެއް ހިމެނޭ އެއްޗަކަށް ވާތީ، އޮމިކްސް އަށް ބިނާކޮށް ގިނަ ދިރާސާތަކަށް ބަލާއިރު، މުޅި ސެލްތަކެއްގެ ގޮތުގައި ޚިޔާރުކޮށްގެން ވަކިކުރުމަކީ އަދިވެސް ގޮންޖެހުމެކެވެ. އެހެން ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ (ޚާއްޞަކޮށް ބޮޑެތި މީހުންގެ ޓިޝޫތަކުގައި) ތަޣައްޔަރުވުމުގެ މުޅިން ނެތްކަން ހާސިލްކުރުމަކީ ގާތްގަނޑަކަށް ކުރެވޭނެ ކަމެއް ނޫން ނަމަވެސް، އަޅުގަނޑުމެން ޑައުންސްޓްރީމް ޕްރޮޓީއޮމިކްސް އެނަލިސިސްއަށް އެކަށީގެންވާ އަދަދަކަށް ދިރިހުރި ނިއުރޯންތައް ހޯދުމަށް އެފްއޭސީއެސް އާއި އެކު ފައިދާހުރި ޑިސޮސިއޭޝަން ސްޓެޕްއެއް ގުޅުވައިލީމެވެ. މުޅި ސެލްތަކުގެ ދިރިހުރުމުގެ ޤާބިލުކަން ރައްކާތެރިކޮށް، މިތަނުގައި އަޅުގަނޑުމެން ފޯރުކޮށްދޭ އުސޫލުން މައިޓޮކޮންޑްރިއާގައި މެޓަބޮލިކް މަގުތަކަށް އަންނަ ބަދަލުތައް ޗެކްކުރުމުގެ އިތުރުން، އޭގެ ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ކައުންޓަރޕާރޓްސް އަށް އަންނަ ބަދަލުތައް ޗެކްކުރުމުގެ ފުރުޞަތު ލިބިގެންދެއެވެ. އަޅުގަނޑުމެން މި ސިފަކުރާ އުސޫލަކީ ހަމައެކަނި ޕަރކިންޖޭ ސެލްތައް ދިރާސާކުރުމާ ގުޅުންހުރި ގޮތެކެވެ.
އެންމެ ފަހުން މި މެޓަބޮލިކް ރީއެރެންޖްމަންޓް ޕްރޮސެސްގެ ތެރޭގައި ސެލްއުލަރ ސްޓްރެސްގެ މުހިއްމު އަލާމާތްތައް މުޅިން ރިވަރސްކޮށް ނިއުރޯނަލް ޑިޖެނެރޭޝަން ހުއްޓުވޭނެ ތެރަޕީޓިކް ވިންޑޯއެއް އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފާހަގަކުރެވިފައިވެއެވެ. އެހެންކަމުން މިތަނުގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ރީވައިރިންގގެ ފަންކްޝަނަލް އިމްޕްލިކޭޝަންސް ވިސްނުމުން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑިސްފެންޝަންގެ ތެރޭގައި ނިއުރޯނަލް ވައިއޭބިލިޓީ ދެމެހެއްޓުމަށް ކުރެވިދާނެ ފަރުވާތަކުގެ އަސާސީ ވިސްނުންތަކެއް ލިބިދާނެއެވެ. ސިކުނޑީގެ އެހެން ސެލް ވައްތަރުތަކުގައި ހަކަތަ މެޓަބޮލިޒަމްއަށް އަންނަ ބަދަލުތައް ޑިސެކްޓް ކުރުމަށް އަމާޒުކޮށްގެން ކުރިއަށް އޮތް ދިރާސާތަކުން މި އުސޫލު ނިއުރޯލޮޖިކަލް އެހެން ބަލިތަކަށް ވެސް އަމަލުކުރެވޭނެކަން ފުރިހަމައަށް ހާމަކުރަން ޖެހެ އެވެ.
މައިޓޯޕާކް މައިސް މީގެ ކުރިން ވެސް ސިފަކޮށްފައިވެއެވެ ( 31 ). ކުރިން loxP ފްލެންކިންގ Mfn2 ޖީން ހުންނަ C57BL/6N މަސްތައް ސިފަކުރެވިފައިވެއެވެ (18) އަދި L7-Cre މަސްތަކާ ކްރޮސްކޮށްފައިވެއެވެ (23). އެއަށްފަހު ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ޑަބަލް ހެޓެރޯޒައިގަސް ޕްރޮޖެނީ ހޯމޯޒައިގަސް Mfn2loxP/Mfn2loxP މައިސް އާއި ކްރޮސްކޮށް Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) އަށް ޕަރކިންޖޭ އަށް ޚާއްޞަ ޖީން ނޮކްއައުޓްސް އުފެއްދިއެވެ. ޖިންސީ ގުޅުން ހިންގުމުގެ ސަބްސެޓެއްގައި ޖީޓީ (ROSA26) ސޯރސްޓޮޕް-މައިޓޯ-ވައިއެފްޕީ އެލިލް (ސްޓޮޕް-އެމްޓީވައިއެފްޕީ) ތަޢާރަފްކޮށްފައިވަނީ އިތުރު ކްރޮސްތަކެއް މެދުވެރިކޮށެވެ (20). ޖަނަވާރުތަކުގެ ހުރިހާ ޕްރޮސީޖަރެއް ވެސް ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ ޔޫރަޕާއި ގައުމީ އަދި މުއައްސަސާތަކުގެ ގައިޑްލައިންތަކާ އެއްގޮތަށް ކަމަށާއި ޖަރުމަނުގެ ނޯތު ރައިން ވެސްޓްފަލިއާގެ އުމްވެލްޓް އަދި ވަރބްރައުޗަރސްޗުޓްޒްގެ ލަންޑެސަމްޓްފޫރްނަޗަރ އިން ފާސްކޮށްފައިވާ ކަމަށެވެ. ޖަނަވާރުތަކުގެ މަސައްކަތް ވެސް ކުރެވެނީ ޔޫރަޕިއަން ފެޑެރޭޝަން އޮފް ލެބޯޓްރީ އެނިމަލް ސައިންސަސް އެސޯސިއޭޝަންސްގެ އިރުޝާދުގެ ދަށުންނެވެ.
މާބަނޑު އަންހެންމީހާގެ ސާވިކަލް ޑިސްލޮކޭޝަން ހޭނައްތާލުމަށްފަހު މައުސް އެމްބްރިއޯ އެކަހެރިކުރެއެވެ (E13). 10 އެމްއެމް ހެޕެސް ސަޕްލިމެންޓްކޮށްފައިވާ ހެންކްސްގެ ބެލެންސްޑް ސޯލްޓް ސޮލިއުޝަން (އެޗްބީއެސްއެސް) ގައި ކޮޓަކްސް ޑިސެކްޓްކޮށް، ޕަޕެއިން (20 ޔޫ/އެމްއެލް) އަދި ސިސްޓައިން (1μg/ml) ހިމެނޭ ޑަލްބެކޯގެ މޮޑިފައިޑް އީގަލްސް މީޑިއަމް އަށް ފޮނުވާފައިވެއެވެ. ޑީއެމްއީއެމް ގައި ޓިޝޫ އިންކިއުބޭޓްކޮށް) އެންޒައިމެޓިކް ޑައިޖެސްޝަން މެދުވެރިކޮށް ޑިސޯސިއޭޓް ކުރުން. އެމްއެލް) 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 20 މިނެޓް ވަންދެން ބެހެއްޓުމަށްފަހު، %10 ފީޓަލް ބޮވައިން ސީރަމް ސަޕްލިމެންޓް ކޮށްފައިވާ ޑީއެމްއީއެމް ގައި މެކޭނިކަލީ މިލްޑް ކޮށްލާށެވެ. ސެލްތައް ސީޑްކޮށްފައިވަނީ ޕޮލިލައިސިން ކޯޓްކޮށްފައިވާ ބިއްލޫރި ކަވަރސްލިޕްތަކުގައި 6 ސެންޓިމީޓަރުގެ ކަލްޗަރ ޑިޝްއަކަށް 2×106 ގެ ޑެންސިޓީއެއްގައި ނުވަތަ 0.5×105 ސެލް/ސެންޓިމީޓަރުގެ ޑެންސިޓީއެއްގައި އިމޭޖިންގ އެނަލިސިސްއަށްޓަކައެވެ. 4 ގަޑިއިރު ފަހުން މީޑިއަމް ބަދަލުކޮށްފައިވަނީ %1 ބީ27 ސަޕްލިމެންޓާއި 0.5 އެމްއެމް ގްލޫޓާމެކްސް ހިމެނޭ ނިއުރޯބެސަލް ސީރަމް ފްރީ މީޑިއަމް އަށެވެ. އެއަށްފަހު މުޅި ތަޖުރިބާގައި ނިއުރޯންތައް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަދި %5 ސީއޯ2 ގައި ބެހެއްޓުމަށްފަހު، ހަފްތާއަކު އެއްފަހަރު ކާންދިނެވެ. އިން ވިޓްރޯގައި ރިކޮމްބިނޭޝަން އުފެއްދުމަށްޓަކައި، އިން ވިޓްރޯގައި ދެވަނަ ދުވަހު ނިއުރޯންތަކަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ތިރީގައިވާ އޭއޭވީ9 ވައިރަސް ވެކްޓަރގެ 3μl (24 ވަޅުގެ ކަލްޗަރ ޑިޝް) ނުވަތަ 0.5μl (24 ވަޅުގެ ޕްލޭޓް) ބޭނުންކުރިއެވެ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (އެޑްޖީން، ކެޓަލަގް ނަންބަރު 105530-AAV9) އަދި AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (އެޑްޖީން، ކެޓަލަގް ނަންބަރު 105545-AAV9) އެވެ.
މައުސް Mfn1 އަދި Mfn2 ކޮމްޕްލިމެންޓަރީ ޑީއެންއޭ (އެޑްޖީން ޕްލާސްމިޑް #23212 އަދި #23213 އިން ލިބިފައިވާ) ސީ-ޓާރމިނަސްގައި V5 ސިކުއެންސް (GKPIPNPLLGLDST) އިން މާކްކޮށް، ޓީ2އޭ ސިކުއެންސް މެދުވެރިކޮށް ފްރޭމްގައި mCherry އާއި ފިއުޒް ކުރެވެއެވެ. Grx1-roGFP2 އަކީ ހައިޑަލްބަރގް ޓީޕީ ޑިކް ޑީއެފްކޭޒެޑް (ޑޮއިޗެސް ކްރެބްސްފޯރޝުންގްސްޒެންޓްރަމް) ގެ ހަދިޔާއެކެވެ. އާންމު ކްލޯނިންގ އުސޫލުތައް ބޭނުންކޮށްގެން tdTomato ކެސެޓް ބަދަލުކޮށްގެން، ކެސެޓް pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ބެކްބޯން (Addgene ރެފަރެންސް ނަންބަރު 28306) އަށް ސަބްކްލޯންކޮށްގެން pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 އަދި... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ވެކްޓަރސް އެވެ. މިފަދަ ސްޓްރެޓެޖީއެއް ބޭނުންކޮށްގެން ކޮންޓްރޯލް ވެކްޓަރ pAAV-CAG-FLEX-mCherry އުފެއްދިއެވެ. AAV-shPCx ކޮންސްޓްރަކްޓް އުފެއްދުމަށްޓަކައި، ޕްލާސްމިޑް AAV ވެކްޓަރ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ބޭނުންވާއިރު، މިއީ މައުސް PCx އަށް އަމާޒުކޮށްގެން shRNA އިންކޯޑްކުރާ ޑީއެންއޭ ސިކުއެންސް (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) އެވެ 3′) ޔޫ6 ޕްރޮމޯޓަރުގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުން އެމްޗެރީ ބޭނުންކުރަނީ ސީއެމްވީ ޕްރޮމޯޓަރުގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުންނެވެ. އެހީތެރި އޭއޭވީ ވެކްޓަރ އުފެއްދުމުގެ މަސައްކަތް ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އިރުޝާދުގެ މަތިން (ސެލް ބަޔޯލެބްސް) އެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ގެންގުޅޭ ޓްރާންސްފާ ޕްލާސްމިޑް ޓްރާންސިއެންޓްލީ ޓްރާންސްފެކްޝަން އޮފް 293AAV ސެލްސް-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ނުވަތަ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ކޯޑިންގ ޖީންގެ އިތުރުން AAV1 ކެޕްސިޑް ޕްރޮޓީން އަދި އެކްސެސަރީ ޕްރޮޓީން ކޯޑިންގ ޕެކޭޖިންގ ޕްލާސްމިޑް ޕްލާސްމިޑް، ކެލްސިއަމް ފޮސްފޭޓް މެތެޑެއް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. މި ކްރޫޑް ވައިރަސް ސުޕަރނެޓެންޓް ހޯދާފައިވަނީ ހިކި އައިސް/އީތަނަލް ބާތެއްގައި ފްރީޒް-ތޯ ސައިކަލްތަކާއި ފޮސްފޭޓް ބަފަރޑް ސެލައިން (ޕީބީއެސް) ގައި ލައިޒް ކޮށްފައިވާ ސެލްތަކުންނެވެ. އޭއޭވީ ވެކްޓަރ ޑިސްކޮންޓިނިއުއަސް އަޔޮޑިކްސަނޯލް ގްރޭޑިއަންޓް އަލްޓްރާސެންޓްރިފިގޭޝަން (32،000 އާރްޕީއެމް އަދި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 24 ގަޑިއިރު) އިން ޕިއުރިފައިކޮށް، އެމިކޮން އަލްޓްރާ-15 ސެންޓްރިފިއުގަލް ފިލްޓަރ ބޭނުންކޮށްގެން ކޮންސެންޓްރޭޓް ކުރިއެވެ. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ޖީނޯމް ކޮޕީ (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG- FLEX ގެ ޖީނޯމް ޓައިޓަރ ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް (54)، ރިއަލް ޓައިމް ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕީސީއާރު (qPCR) އިން ވަޒަންކޮށްފައިވެއެވެ. -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) އަދި AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) އެވެ.
ޕްރައިމަރީ ނިއުރޯންތައް އައިސް ކޯލްޑް 1x ޕީބީއެސްގައި ސްކްރޭޕްކޮށް، ޕެލެޓްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ފޮސްފޭޓޭޒް އަދި ޕްރޮޓީޒް އިންހިބިޓަރ (ރޯޝް) ހިމެނޭ 0.5% ޓްރައިޓަން އެކްސް-100 / 0.5% ސޯޑިއަމް ޑިއޮކްސީކޮލެޓް/ޕީބީއެސް ލައިސިސް ބަފަރ ގައި ހޯމޯޖެނައިޒް ކުރިއެވެ. ޕްރޮޓީން ކުއަންޓިފިކޭޝަން ހެދީ ބައިސިންކޮނިނިކް އެސިޑް އެސޭ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެއަށްފަހު އެސްޑީއެސް-ޕޮލިއެކްރިލަމައިޑް ޖެލް އިލެކްޓްރޯފޯރެސިސް މެދުވެރިކޮށް ޕްރޮޓީންތައް ވަކިކޮށް، ޕޮލިވިނިލިޑީން ފްލޫރައިޑް މެމްބަރޭން (ޖީއީ ހެލްތްކެއާ) އަށް ބްލޮޓް ކުރި އެވެ. ވަކި ތަންތަން ނޫން ތަންތަން ބްލޮކްކޮށް ޕްރައިމަރީ އެންޓިބޮޑީ (ތަފްސީލް އަށް ތާވަލް S1 ބައްލަވާ) އާއި އެކު ޓީބީއެސްޓީ (Tris-buffered saline with Tween) ގައި %5 ކިރުގައި އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ދޮވުމުގެ ފިޔަވަޅުތަކާއި ޓީބީއެސްޓީ އިންކިއުބޭޓްގައި ސެކަންޑަރީ އެންޓިބޮޑީ އިންކިއުބޭޓް ކުރުން. ޕްރައިމަރީ އެންޓިބޮޑީ އާއި އެކު +4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. ދޮވުމަށްފަހު ސެކަންޑަރީ އެންޓިބޮޑީ ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 2 ގަޑިއިރު ވަންދެން އުނގުޅާށެވެ. އޭގެ ފަހުން ހަމަ އެ ބްލޮޓް އެންޓި-β-އެކްޓިން އެންޓިބޮޑީ އެއް އިންކިއުބޭޓް ކުރުމުން ހަމަ ލޯޑިންގ އެއް ކަށަވަރު ކުރެވުނެވެ. ކެމިލޫމިނެސެންސް އަށް ބަދަލުވެ ކެމިލޫމިނެސެންސް (ޖީއީ ހެލްތްކެއާ) އިތުރުކޮށްގެން ހޯދުން.
ކުރިން ބިއްލޫރި ކަވަރސްލިޕްތަކުގައި ސީޑްކޮށްފައިވާ ނިއުރޯންތައް %4 ޕެރަފޯރމަލްޑައިޑް (ޕީއެފްއޭ)/ޕީބީއެސް އިން ކަނޑައެޅިފައިވާ ވަގުތު ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ފިކްސްކޮށްފައިވެއެވެ. ފުރަތަމަ ކަވަރސްލިޕްތައް ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން %0.1 ޓްރައިޓަން އެކްސް-100/ޕީބީއެސް އިން ޕަރމިއޭޓްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ބްލޮކިންގ ބަފަރ [3% ބޮވައިން ސީރަމް އެލްބިއުމިން (BSA)/PBS] ގައި ޕަރމިއޭޓް ކުރެއެވެ. ދެވަނަ ދުވަހު ކަވަރސްލިޕްތައް ބްލޮކިންގ ބަފަރ އިން ދޮވެ، އެކަށީގެންވާ ފްލޫރޯފޯރ ކޮންޖަގޭޓެޑް ސެކަންޑަރީ އެންޓިބޮޑީ އާއި އެކު ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 2 ގަޑިއިރު ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ؛ އެންމެ ފަހުން ސާމްޕަލްތައް ޕީބީއެސްގައި ރަނގަޅަށް ދޮވެފައިވަނީ 4′،6-ޑައިމިޑިނޯ-2 -ފެނިލިންޑޯލް (DAPI) އިން ކައުންޓަރސްޓޭއިންކޮށް، އޭގެ ފަހުން އަކުއާ-ޕޮލީ/މައުންޓް އިން މައިކްރޯސްކޯޕް ސްލައިޑްގައި ފިކްސްކޮށްފައެވެ.
މަސްތަކަށް (ފިރިހެން އަދި އަންހެން) ކެޓަމިން (130 މިލިގްރާމް/ކިލޯގްރާމް) އަދި ޒައިލަޒިން (10 މިލިގްރާމް/ކިލޯގްރާމް) އިންޓްރާޕެރިޓޯނިއަލް އިންޖެކްޝަން ޖަހައިގެން ހޭނައްތާލައި، ކާޕްރޮފެން އެނަލްޖީސިކް (5 މިލިގްރާމް/ކިލޯގްރާމް) ހަމުގެ ދަށުން ދީ، ހޫނު ޕެޑެއް ޖަހާފައިވާ ސްޓިރިއޯޓެކްޓިކް އިންސްޓްރޫމެންޓެއް (ކޮޕްފް) ގައި ބަހައްޓާފައިވެއެވެ. ބޮލުގެ ނާށިގަނޑު ހާމަކޮށް ޑެންޓަލް ޑްރިލް ބޭނުންކޮށްގެން ސެރެބިލަރ ކޮޓަކްސްގެ މިސް ކަށިގަނޑާ ދިމާވާ ބައި ތުނިކޮށް (ލަމްބްޑާ އިން: ޓޭލް 1.8، ލެޓަރަލް 1، ލޮބިއުލްސް IV އަދި V އާއި ދިމާވާ) ތުނިކޮށްލާށެވެ. ކައްސާލާފައިވާ ސިރިންޖް ނިޑަލް ބޭނުންކޮށްގެން ފަރުވާތެރިކަމާއެކު ބޮލުގެ ނާށިގަނޑުގައި ކުޑަ ލޯވަޅެއް ހަދައިގެން ތިރީގައި ހުންނަ ލޭހޮޅިތަކަށް ބުރޫނާރާނެ އެވެ. ދެން ތުނިކޮށް ކުރަހާފައިވާ ބިއްލޫރި ކެޕިލަރީ މަޑުމަޑުން މައިކްރޯ ހޯލް އަށް (ޑޫރާ މެޓަރގެ ވެންޓްރަލް ސައިޑްގައި -1.3 އިން -1 އަށް) ވައްދައި، 10 އާއި 20 މިނެޓާ ދެމެދުގެ މުއްދަތެއްގެ ވިންޑޯއެއްގައި މެނުއަލް ސިރިންޖް (ނަރިޝިގޭ) އިން މައިކްރޯ އިންޖެކްޓަރ (ނަރިޝިގޭ) އިން 200 އާއި 300 ނޯޓް މީޓަރުގެ އޭއޭވީ އެތައް ފަހަރަކު ލޯ ޕްރެޝަރުގައި އިންޖެކްޓް ކުރެއެވެ. އިންފިޝަން އަށް ފަހު އިތުރު 10 މިނެޓް ވަންދެން ކެޕިލަރީ ބަހައްޓައިގެން ވައިރަސް މުޅިން ފެތުރިގެން ދާނެ އެވެ. ކެޕިލަރީތައް ނެގުމަށްފަހު ހަންގަނޑު ފަރުވާތެރިކަމާއެކު ސުޗުއަރ ކުރަނީ ޒަޚަމް ދުޅަވުން އެންމެ ކުޑަކޮށް ޖަނަވާރު ރަނގަޅުވުމަށް ފުރުސަތު ދިނުމަށެވެ. އޮޕަރޭޝަނަށް ފަހު އެތައް ދުވަހެއް ވަންދެން ތަދުކެނޑުމަށް ބޭނުންކުރާ ބޭސް (ކަސްޕޯފެން) އިން ޖަނަވާރުތަކަށް ފަރުވާ ދީފައިވާއިރު، އެ މުއްދަތުގައި އެ ޖަނަވާރުތަކުގެ ޖިސްމާނީ ހާލަތު ފަރުވާތެރިކަމާއެކު މޮނިޓަރކޮށް، އެއަށްފަހު ކަނޑައެޅިފައިވާ ވަގުތުގައި އެ ޖަނަވާރުތައް ކަތިލާފައިވެއެވެ. ހުރިހާ ޕްރޮސީޖަރެއް ވެސް ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ ޔޫރަޕާއި ގައުމީ އަދި މުއައްސަސާތަކުގެ ގައިޑްލައިންތަކާ އެއްގޮތަށް ކަމަށާއި ޖަރުމަނުގެ ނޯތު ރައިން ވެސްޓްފަލިއާގެ އުމްވެލްޓް އަދި ވަރބްރައުޗަރސްޗުޓްޒްގެ ލަންޑެސަމްޓްފޫރްނަޗަރ އިން ފާސްކޮށްފައިވާ ކަމަށެވެ.
ޖަނަވާރުތަކަށް ކެޓަމިން (100 މިލިގްރާމް/ކިލޯގްރާމް) އަދި ޒައިލަޒިން (10 މިލިގްރާމް/ކިލޯގްރާމް) އިން ހޭނައްތާލުމަށްފަހު، ހިތަށް ފުރަތަމަ 0.1 އެމް ޕީބީއެސް ޖަހައި، އޭގެ ފަހުން ޕީބީއެސްގައި %4 ޕީއެފްއޭ ޖަހައިގެން ޕަރފިއުޒް ކުރިއެވެ. މި ޓިޝޫ ޑިސެކްޓްކޮށް %4 ޕީއެފްއޭ/ޕީބީއެސް ގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން ފިކްސް ކޮށްފައިވެއެވެ. ޕީބީއެސްގައި ފިކްސްޑް ބްރެއިން އިން ސެޖިޓަލް ސެކްޝަންސް (50 μm ބޯމިން) ތައްޔާރުކުރުމަށް ވައިބަރޭޓިންގ ނައިފް (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ބޭނުންކުރިއެވެ. އެހެން ގޮތަކަށް ބަޔާންކޮށްފައި ނުވާނަމަ، ފްރީ ފްލޯޓިންގ ސެކްޝަންތަކުގައި ސްޓޭނިންގ ހެދީ މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް (13) ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި ހޫނުކޮށް ހޫނުކޮށްގެންނެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، ފުރަތަމަ ލިބުނު ސްލައިސްތައް %0.5 ޓްރައިޓަން އެކްސް-100/ޕީބީއެސް އިން ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން ޕަރމިއޭބިލައިޒް ކުރިއެވެ؛ ބައެއް އެޕިޓޯޕްތަކަށް (Pcx އަދި Shmt2)، 80 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް (PH 9) ގައި ޓްރިސް-އީޑީޓީއޭ ބަފަރ ގައި މި ފިޔަވަޅުގެ ބަދަލުގައި 25 މިނެޓް ވަންދެން ސްލައިސްތައް ހޫނުކޮށްލާށެވެ. ދެން ސެކްޝަންތައް ޕްރައިމަރީ އެންޓިބޮޑީ (ތާވަލް S1 ބައްލަވާ) އާއި އެކު ބްލޮކިންގ ބަފަރ (3% BSA/PBS) ގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން ހޫނުކުރުމާއެކު އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. ޖެހިގެން އައި ދުވަހު ބްލޮކިންގ ބަފަރ އިން ސެކްޝަންތައް ދޮވެ، އެކަށީގެންވާ ފްލޫރޯފޯރ ކޮންޖަގޭޓެޑް ސެކަންޑަރީ އެންޓިބޮޑީ އާއި އެކު ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 2 ގަޑިއިރު އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ؛ އެންމެ ފަހުން ބައިތައް ޕީބީއެސްގައި ރަނގަޅަށް ދޮވެ، ޑީއޭޕީއައި އިން ކައުންޓަރ ސްޓޭންކޮށް، އޭގެ ފަހުން އަކުއާޕޮލިމައުންޓް އިން މައިކްރޯސްކޯޕް ސްލައިޑެއްގައި ފިކްސް ކުރިއެވެ.
މި ސާމްޕަލްގެ ތަސްވީރު ހެދުމަށް ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ ހުދު އަލި ލޭޒަރާއި 405 ޑައިއޯޑް އަލްޓްރާވައިލެޓް ލޭޒަރެއް ހިމެނޭ ލޭޒަރ ސްކޭނިންގ ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕް (ޓީސީއެސް އެސްޕީ8-އެކްސް ނުވަތަ ޓީސީއެސް ޑިޖިޓަލް ލައިޓް ޝީޓް، ލޭއިކާ މައިކްރޯސިސްޓަމްސް) އެވެ. ފްލޫރޯފޯރ އެކްސައިޓްކޮށް ހައިބްރިޑް ޑިޓެކްޓަރ (HyDs) އިން ސިގްނަލް އެއްކުރުމުން، ސިކުއެންޝަލް މޯޑުގައި ނައިކިސްޓް ސެމްޕްލިންގ އަށް ތަބާވާ ސްޓޭކްޑް އިމޭޖްތައް އެއްކުރުމަށް ލާސް-އެކްސް ސޮފްޓްވެއަރ ބޭނުންކުރިއެވެ: ނޮން-ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕެނަލްތަކަށް، އެއީ ވަރަށް ޑައިނަމިކް ސިގްނަލްތަކެއް (މިސާލަކަށް، ސޮމެޓިކް ސެލްތަކާއި ޑެންޑްރައިޓްސްގައި) mtYFP) ބްރައިޓްއާރ މޯޑުގައި ޕީއެންސްގެ އަދަދު ހޯދުމަށް ހައިޑް ބޭނުންކުރުން). ބެކްގްރައުންޑް ކުޑަކުރުމަށްޓަކައި 0.3 އާއި 6 ns އާއި ދެމެދުގެ ގޭޓިންގ އެއް ޖަހައެވެ.
ސޯރޓް ކުރެވިފައިވާ ސެލްތަކުގެ ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ. %1 ބީ27 ސަޕްލިމެންޓާއި 0.5 އެމްއެމް ގްލޫޓާމެކްސް ހިމެނޭ ނިއުރޯބެސަލް-އޭ މީޑިއަމްގައި ސޯޓް ކުރުމަށްފަހު، ސެލްތައް ވަގުތުން ޕޮލީ-އެލް-ލައިސިން ކޯޓް ކޮށްފައިވާ ބިއްލޫރި ސްލައިޑްތަކުގައި (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) ސީޑްކޮށް، ސެލްތައް ސެޓްލްވާން 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަދި %5 CO2 ގައި 1 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓިއެވެ. ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ ހެދީ ހުދު ލޭޒަރ، ހައިޑީ، 63×[1.4 ނިއުމެރިކަލް އެޕަރޗަރ (NA)] އޮއިލް އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސް އަދި ހީޓިންގ ސްޓޭޖެއް ޖަހާފައިވާ ލޭއިކާ އެސްޕީ8 ލޭޒަރ ސްކޭނިންގ ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕެކެވެ.
މައުސް އަވަހަށް ކާބަން ޑައިއޮކްސައިޑް އިން ހޭނެތިދީ ބޯ ކަނޑާލައި، ސިކުނޑި އަވަހަށް ބޮލުގެ ނާށިގަނޑުން ނަގައި، 200μm ބޯމިނުގައި (13C ލޭބަލިންގ ތަޖުރިބާއަށް) ނުވަތަ 275μm ބޯމިނުގައި (ދެ ފޮޓޯން ތަޖުރިބާއަށް) ސެޖިޓަލް ސެކްޝަނަކަށް ކަނޑާލީ ތިރީގައިވާ ތަކެތިން ފުރިފައިވާ The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ފުރިފައިވަނީ ތިރީގައިވާ މާއްދާތަކުންނެވެ: 125 އެމްއެމް އައިސް ކޯލްޑް، ކާބަން ސެޗުރޭޓެޑް (95% O2 އަދި 5% CO2) ލޯ Ca2 + އާޓިފިޝަލް ސެރެބްރޮސްޕައިނަލް ފްލޫޑް (ACSF) NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ސޯޑިއަމް ފޮސްފޭޓް ބަފަރ، 25 mM NaHCO3، 25 mM ގްލޫކޯޒް، 0.5 mM CaCl2 އަދި 3.5 mM MgCl2 (އޮސްމޮޓިކް ޕްރެޝަރ 310 އާއި 330 މިލިމޮލް އާއި ދެމެދުގެ މިންވަރަކަށް) އެވެ. ލިބިފައިވާ ސިކުނޑީގެ ސްލައިސްތައް ޕްރީ އިންކިއުބޭޝަން ޗެމްބަރަކަށް ބަދަލުކޮށްލާށެވެ. މީޑިއަމް) ޕީއެޗް 7.4 އަދި 310 އިން 320 މިލިމޮލް) އެވެ.
އިމޭޖިންގ ޕްރޮސެސްގެ ތެރޭގައި ސްލައިސްތައް ޚާއްޞަ އިމޭޖިންގ ރޫމަކަށް ބަދަލުކޮށް، 32° އާއި 33 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އާއި ދެމެދުގެ ކޮންސްޓަންޓް ޓެމްޕަރޭޗަރެއްގައި ކޮންޓިނިއުއަސް އޭސީއެސްއެފް ޕަރފިއުޝަންގެ ދަށުން ތަޖުރިބާ ކުރިއަށް ގެންދިޔައެވެ. ސްލައިސް އިމޭޖިންގ އަށް ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ ލޭއިކާ 25އެކްސް އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސް (އެންއޭ 0.95، ފެން) އާއި އެކު ތައްޔާރުކޮށްފައިވާ މަލްޓިފޮޓަން ލޭޒަރ ސްކޭނިންގ މައިކްރޯސްކޯޕް (ޓީސީއެސް އެސްޕީ8 އެމްޕީ-އޯޕީއޯ، ލޭއިކާ މައިކްރޯސިސްޓަމްސް) އެވެ. އެފްއެލްއައިއެމް މޮޑިއުލް (ޕިކޯހާރޕް300، ޕިކޯކުއަންޓް) އެވެ.
Grx1-roGFP2 ގެ އެފް.އެލް.އައި.އެމް. ޕީއެންތަކުގެ ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ރެޑޮކްސް ސްޓޭޓަށް އަންނަ ބަދަލުތައް މިންކުރީ ސެޖިޓަލް ބްރެއިން ސްލައިސްތަކުގައި ޓޫ-ފޮޓޯން އެފްއެލްއައިއެމް އިން ކަމަށާއި، މިތަނުގައި Grx1-roGFP2 ބަޔޯސެންސަރ އިން ޕީއެންސް އަށް އަމާޒުކޮށްފައިވެއެވެ. ޕީއެން ލޭޔަރގައި، އެކްވިޒިޝަން ފީލްޑް ހޮވަނީ ސްލައިސް ސަރފޭސްގެ ތިރީގައި ގާތްގަނޑަކަށް 50 އާއި 80 μm އަށް ވައިއޭބަލް ޕީއެން (އެބަހީ، ޑެންޑްރައިޓްސް އާއި އެކު ބީޑްޑް ސްޓްރަކްޗަރ ނުވަތަ ނިއުރޯނަލް މޯރފޮލޮޖިކަލް ބަދަލުތައް ނެތުން) އަދި ޑަބަލް ޕޮޒިޓިވް roGFP2 ސެންސަރ އަދި AAV އިންކޯޑިންގ shRNA PCx ނުވަތަ އޭގެ ކޮންޓްރޯލް ސިކުއެންސް (ކޮންމެ އެއްޗަކީ mCherry ކޯ-އެކްސްޕްރެސްކުރާ) ހުރިތޯއެވެ. 2x ޑިޖިޓަލް ޒޫމް އާއި އެކު ސިންގަލް ސްޓޭކް އިމޭޖްތައް އެއްކުރުން [އެކްސައިޓޭޝަން ވޭވްލެންޖް: 890 ނޯޓް މީޓަރު؛ 512 ނޯޓް މީޓަރު 512 ޕިކްސެލް]. ޑިޓެކްޝަން: އިންޓަރނަލް ހައިޑީ، ފްލޫރެސިން އައިސޮތިއޮސައިނެޓް (އެފްއައިޓީސީ) ފިލްޓަރ ގްރޫޕް] އަދި 2 އާއި 3 މިނެޓުގެ ތެރޭގައި އިމޭޖް އެވްރެޖިންގ ބޭނުންކޮށްގެން ކަރވް ފިޓިންގ އަށް ބޭނުންވާ ވަރަށް ފޮޓޯން އެއްކުރެވިފައިވާކަން (ޖުމްލަ 1000 ފޮޓޯން) ޔަޤީންކުރުން. Grx1-roGFP2 ޕްރޯބްގެ ނާޒުކުކަމާއި FLIM ޝަރުތުތައް ޔަގީންކުރުމުގެ މަސައްކަތް ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ ޕަރފިއުޝަން ACSF އަށް އެގްޒޯޖެނަސް 10 mM H2O2 އިތުރުކުރުމުން (އޮކްސިޑޭޝަން މެކްސިމަޒް ކުރުމަށްޓަކައި، ލައިފްސްޕަން އިތުރުވުމަށް)، އަދި އޭގެ ފަހުން 2 mM ޑައިތިއޮތްރެއިޓޯލް އިތުރުކުރުމުން (ރިޑަކްޝަންގެ މިންވަރު އެންމެ ކުޑަކޮށް، ދަށްވުން ދަށްވުމުން) roGFP2 ގެ ލައިފްސްޕަން ވެލިއު މޮނިޓަރކޮށްގެންނެވެ އިން ލައިފްސްޕަން) (ފޮޓޯ އެސް8، ޑީ އިން ޖީ) އެވެ. ހޯދިފައިވާ ނަތީޖާތައް ތަޙުލީލުކުރުމަށް FLIMfit 5.1.1 ސޮފްޓްވެއަރ ބޭނުންކޮށްގެން، މުޅި ތަސްވީރުގެ އެއް އެކްސްޕޮނޭންޝަލް ޑީކޭއި ކަރވް މިންކުރެވުނު އައިއާރްއެފް (އިންސްޓްރޫމެންޓް ރެސްޕޮންސް ފަންކްޝަން) އަށް ފިޓްކޮށް، χ2 އަކީ ގާތްގަނޑަކަށް 1.
މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕޮޓެންޝަލް އެނަލިސިސް. އެކިއުޓް ސެކްޝަން ސީދާ ޕަރފިއުސްޑް އޭސީއެސްއެފް އަށް އެޅިފައިވާ 100 ނޯޓް މީޓަރު ޓީއެމްއާރްއެމް އާއި އެކު 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރުމަށްފަހު، ޕީއެންތަކުގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕޮޓެންޝަލް ބަދަލުތައް ދެ ފޮޓޯން މައިކްރޯސްކޯޕަކުން ވަޒަންކުރިއެވެ. ޓީއެމްއާރްއެމް އިމޭޖިންގ ހެދީ 920 ނޯޓް މީޓަރުގައި ޕްރޯބް އެކްސައިޓްކޮށް، ސިގްނަލްތައް އެއްކުރުމަށް އިންޓަރނަލް ހައިޑީ (ޓެޓްރަމެތައިލްރޯޑަމިން އައިސޮތިއޮސައިނެޓް: 585/40 ނޯޓް މީޓަރު) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ؛ އެއް އެކްސައިޓޭޝަން ވޭވްލެންޖް ބޭނުންކޮށްގެން ނަމަވެސް ތަފާތު އިންޓަރނަލް ހައިޑް (FITC :525/50) ބޭނުންކޮށްގެން mtYFP އިމޭޖް ކޮށްގެންނެވެ. އެއް ސެލް ލެވެލްގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕޮޓެންޝަލް ވަޒަންކުރުމަށް އިމޭޖްޖޭގެ އިމޭޖް ކެލްކިއުލޭޓަރ ޕްލަގް-އިން ބޭނުންކުރުން. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، ޕްލަގް-އިން އިކުއެޝަން: signal = min (mtYFP, TMRM) ބޭނުންކުރަނީ، އެ ޗެނަލްގެ ސިންގަލް ސްޓޭކް ކޮންފޯކަލް އިމޭޖްގައި ޕަރކިންޖޭ ސޯމާލީ ބަހުން ޓީއެމްއާރްއެމް ސިގްނަލް ދައްކާ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ރީޖަން ދެނެގަތުމަށެވެ. ދެން ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން އުފެދޭ މާސްކްގައިވާ ޕިކްސެލް އޭރިއާ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ވަޒަންކޮށް، އޭގެ ފަހުން mtYFP ޗެނަލްގެ ގުޅޭ ތްރެޝްހޯލްޑް ސިންގަލް ސްޓޭކް އިމޭޖްގައި ނޯމަލައިޒްކޮށް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޕޮޓެންޝަލް ދައްކާ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފްރެކްޝަން ހޯދައެވެ.
މި ތަސްވީރު ޑިކޮންވޮލޫޓްކޮށްފައިވަނީ ހޫޖެންސް ޕްރޯ (ސައިންޓިފިކް ވޮލިއުމް އިމޭޖިން) ސޮފްޓްވެއާ އިންނެވެ. ޓައިލްސްގެ ސްކޭން ކުރެވިފައިވާ ތަސްވީރުތަކަށް އެއް ޓައިލްގެ މޮންޓޭޖް ހެދެނީ ލާސް-އެކްސް ސޮފްޓްވެއާ އިން ފޯރުކޮށްދޭ އޮޓޮމެޓިކް ސްޓިޗިން އެލްގޮރިޒަމް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އިމޭޖް ކެލިބްރޭޝަނަށްފަހު އިމޭޖްޖޭ އަދި އެޑޯބް ފޮޓޯޝޮޕް ބޭނުންކޮށްގެން އިމޭޖް އިތުރަށް ޕްރޮސެސްކޮށް، ބްރައިޓްނެސް އާއި ކޮންޓްރެސްޓް އެއްގޮތަކަށް އެޖެސްޓް ކުރާށެވެ. ގްރެފިކް ތައްޔާރުކުރުމަށް އެޑޯބް އިލަސްޓްރޭޓަރ ބޭނުންކުރުން.
އެމްޓީޑީއެންއޭ ފޯކަސް އެނަލިސިސް. އެމްޓީޑީއެންއޭ ލޭޝަންތަކުގެ އަދަދު ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕް މެދުވެރިކޮށް ޑީއެންއޭއާ ދެކޮޅަށް އެންޓިބޮޑީސް ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ސެރެބިލަރ ސެކްޝަންތަކުގައި ވަޒަންކޮށްފައިވެއެވެ. ކޮންމެ ޓާގެޓް އޭރިއާއެއް އުފައްދާފައިވަނީ ސެލްގެ ހަށިގަނޑާއި ކޮންމެ ސެލްއެއްގެ ނިއުކްލިއަސްއަށް ކަމަށާއި، އެ އޭރިއާއެއް ހޯދާފައިވަނީ މަލްޓި މީސަރ ޕްލަގް-އިން (އިމޭޖްޖޭ ސޮފްޓްވެއަރ) ބޭނުންކޮށްގެން ކަމަށެވެ. ސެލް ބޮޑީ އޭރިއާ އިން ނިއުކްލިއަރ އޭރިއާ އުނިކޮށް ސައިޓޯޕްލާސްމިކް އޭރިއާ ހޯދާށެވެ. އެންމެ ފަހުން އެނަލައިޒް ޕާޓިކަލްސް ޕްލަގް-އިން (އިމޭޖްޖޭ ސޮފްޓްވެއާ) ބޭނުންކޮށްގެން ތްރެޝްހޯލްޑް އިމޭޖްގައި އެމްޓީޑީއެންއޭ ދައްކާ ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ޑީއެންއޭ ޕޮއިންޓްތައް އޮޓޮމެޓިކުން ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ވަޒަންކޮށް، ލިބުނު ނަތީޖާތައް ސީޓީއާރުއެލް މަސްތަކުގެ ޕީއެން އެވްރެޖަށް ނޯމަލައިޒް ކުރި އެވެ. މި ނަތީޖާތައް ހާމަކޮށްފައިވަނީ ސެލްއެއްގައި ނިއުކްލިއޯސައިޑްގެ އެވްރެޖް އަދަދުގެ ގޮތުގައެވެ.
ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް. އެއް ސެލް ލެވެލްގައި ޕީއެންގައި ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން ވަޒަންކުރުމަށް އިމޭޖްޖޭގެ އިމޭޖް ކެލްކިއުލޭޓަރ ޕްލަގް-އިން ބޭނުންކުރުން. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، ގުޅޭ ޗެނަލްގެ ސިންގަލް ލޭޔަރ ކޮންފޯކަލް އިމޭޖްގައި، އިކުއެޝަން މެދުވެރިކޮށް: ސިގްނަލް = min (mtYFP, antibody)، ޕަރކިނާގައި ވަކި އެންޓިބޮޑީއަކަށް އިމިއުނޯރިއެކްޓިވިޓީ ދައްކާ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ރީޖަން ދެނެގަނެވޭނެއެވެ. ދެން ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބޭ މާސްކްގައިވާ ޕިކްސެލް އޭރިއާ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ވަޒަންކޮށް، ދެން އެމްޓީވައިއެފްޕީ ޗެނަލްގެ ގުޅޭ ތްރެޝްހޯލްޑް ސިންގަލް ސްޓޭކް އިމޭޖްގައި ނޯމަލައިޒްކޮށް، ދައްކާ ޕްރޮޓީންގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ފްރެކްޝަން ހޯދައެވެ.
ޕަރކިންޖޭ ސެލް ޑެންސިޓީ އެނަލިސިސް. އިމޭޖްޖޭގެ ސެލް ކައުންޓަރ ޕްލަގް-އިން ބޭނުންކޮށްގެން ޕަރކިންޖޭ ޑެންސިޓީ ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ ގުނާފައިވާ ޕަރކިންޖޭ ސެލްތަކުގެ އަދަދު ގުނާފައިވާ ސެލްތަކުން ހިފާފައިވާ ސެރެބިލަރ ރިންގްގެ ދިގުމިނަށް ބަހާލައިގެންނެވެ.
ސާމްޕަލް ތައްޔާރުކުރުމާއި އެއްކުރުން. ކޮންޓްރޯލް ގްރޫޕާއި Mfn2cKO މަސްތަކުގެ ސިކުނޑިތައް 0.1 M ފޮސްފޭޓް ބަފަރ (PB) ގައި %2 PFA/2.5% ގްލޫޓަރަލްޑައިޑްގައި ފިކްސްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ކޮރޮނަލް ސެކްޝަންތައް ތައްޔާރުކޮށްފައިވަނީ ސިލިއޭޓްސް (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (ތުނިމިން 50 އިން 60 μm) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ %1.5 ޕޮޓޭސިއަމް ފެރޯސައިނައިޑް ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 1 ގަޑިއިރު ވަންދެން ބެހެއްޓުން. މި ބައިތައް ޑިސްޓިލްޑް ފެނުން ތިން ފަހަރު ދޮވެ، އޭގެ ފަހުން %1 ޔޫރެނިލް އެސިޓެޓް ހިމެނޭ %70 އީތަނަލް އިން 20 މިނެޓް ވަންދެން ސްޓެއިން ކުރިއެވެ. އެއަށްފަހު ސެކްޝަންތައް ގްރޭޑް ކުރެވިފައިވާ އަލްކޮހޯލްގައި ޑީހައިޑްރޭޓްކޮށް ސިލިކަން ކޯޓްކޮށްފައިވާ ބިއްލޫރި ސްލައިޑްތަކުގެ މެދުގައި ޑަރކުޕަން އޭސީއެމް (އަރަލްޑައިޓް ކާސްޓިންގ ރެސިން އެމް) އިޕޮކްސީ ރެސިން (އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯސްކޯޕީ ސައިންސަސް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު 14040) ގައި ޖައްސައި، އެންމެ ފަހުން 60 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އަވަނުގައި 48 ގަޑިއިރު ޕޮލިމަރައިޒް ކުރިއެވެ. ސެރެބިލަރ ކޮޓަކްސް އޭރިއާ ހޮވައި 50 ނޯޓް މީޓަރުގެ އަލްޓްރާތިން ސެކްޝަންތައް ލޭއިކާ އަލްޓްރާކަޓް (ލޭއިކާ މައިކްރޯސިސްޓަމް ޖީއެމްބީއެޗް، ވިއެނާ، އޮސްޓްރިއާ) އިން ކަނޑައި ޕޮލިސްޓައިރިން ފިލްމް ކޯޓްކޮށްފައިވާ 2×1 އެމްއެމް ކޮޕަރ ސްލިޓް ގްރިޑެއްގައި ހޮވާފައިވެއެވެ. މި ބައިތައް %4 ޔޫރެނިލް އެސިޓެޓްގެ ސޮލިއުޝަނަކުން H2O ގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ސްޓޭންކޮށް، H2O އިން އެތައް ފަހަރަކު ދޮވެ، ދެން H2O ގައި ރެއިނޯލްޑްސް ލީޑް ސައިޓްރޭޓް އިން 10 މިނެޓް ވަންދެން ދޮވެ، H2O އިން އެތައް ފަހަރަކު ދޮވެފައިވެއެވެ. މައިކްރޯގްރާފްތައް ނަގާފައިވަނީ ޓްރާންސްމިޝަން އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯސްކޯޕް ފިލިޕްސް ސީއެމް100 (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ވޯލްތަމް، އެމްއޭ، ޔޫއެސްއޭ) އިން ޓީވީއައިޕީއެސް (ޓިއެޓްޒް ވީޑިއޯ އެންޑް އިމޭޖް ޕްރޮސެސިންގ ސިސްޓަމް) ޓެމްކެމް-އެފް416 ޑިޖިޓަލް ކެމެރާ (ޓީވީއައިޕީއެސް ޖީއެމްބީއެޗް، ގޯޓިންގ، ޔޫއެސްއޭ) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ޖަރުމަނުވިލާތް).
އޭއޭވީ ޖެހިފައިވާ މަސްތަކަށް ސިކުނޑި ވަކިކޮށް 1 އެމްއެމް ބޯ ސެޖިޓަލް ސެކްޝަނަކަށް ކޮށާލުމަށްފަހު، އޭއޭވީ ޖެހިފައިވާ އަނގޮޓި (އެބަހީ، އެމްޗެރީ އެކްސްޕްރެސް) ދެނެގަތުމަށް ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯސްކޯޕް ބޭނުންކޮށްގެން ސެރެބެލަމް ބެލިއެވެ. އޭއޭވީ އިންޖެކްޝަން ޖެހުމުން މަދުވެގެން ޖެހިޖެހިގެން ދެ ސެރެބިލަރ ރިންގްގައި ޕަރކިންޖޭ ސެލް ލޭޔަރ (އެބަހީ ގާތްގަނޑަކަށް މުޅި ލޭޔަރ) ގެ ޓްރާންސްޑަކްޝަން އެފިޝަންސީ ވަރަށް މަތިވާ ތަޖުރިބާތަކެވެ. އޭއޭވީ ޓްރާންސްޑޫސްޑް ލޫޕް މައިކްރޯޑިސެކްޓްކޮށް އެއްރޭ ވަންދެން ޕޯސްޓް ފިކްސޭޝަން (0.1 އެމް ކޯކޯޓް ބަފަރ ގައި %4 ޕީއެފްއޭ އަދި %2.5 ގްލޫޓަރަލްޑައިޑް) އަށް އިތުރަށް ޕްރޮސެސް ކުރިއެވެ. އީޕީއޯއެން އެންބެޑިންގ އަށް ފިކްސްޑް ޓިޝޫ 0.1 އެމް ސޯޑިއަމް ކޯކޯޓް ބަފަރ (އެޕްލިޗެމް) އިން ދޮވެ، 0.1 އެމް ސޯޑިއަމް ކޯކޯޓް ބަފަރ (އެޕްލިޗެމް) ގައި %2 OsO4 (os, Science Services; Caco) އާއި އެކު 4 ގަޑިއިރު އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ދެން 2 ގަޑިއިރު ދޮވެފައިވެއެވެ. 0.1 އެމް ކޮކަމައިޑް ބަފަރ އިން 3 ފަހަރު ތަކުރާރު ކުރާށެވެ. އޭގެ ފަހުން އީތަނަލްގެ އެސެންޑިންގ ސީރީޒް ބޭނުންކޮށްގެން ކޮންމެ އީތަނަލް ސޮލިއުޝަނެއް 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށް ޓިޝޫ ޑީހައިޑްރޭޓް ކުރިއެވެ. މި ޓިޝޫ ޕްރޮޕައިލީން އޮކްސައިޑަށް ބަދަލުކޮށް 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އީޕީއޯއެން (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) ގައި އެއްރޭ ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި ތާޒާ އީޕީއޯއެން ގައި 2 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓުމަށްފަހު، 62 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 72 ގަޑިއިރު ވަންދެން ޖައްސާށެވެ. އަލްޓްރާމައިކްރޮޓޯމް (Leica Microsystems, UC6) އާއި ޑައިމަންޑް ވަޅި (Diatome, Biel, Switzerland) ބޭނުންކޮށްގެން 70 ނޯޓް މީޓަރުގެ އަލްޓްރާތިން ބައިތައް ކަނޑައި، %1.5 ޔޫރެނިލް އެސިޓެޓް އިން 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން ސްޓޭންކޮށް، ލީޑް ސައިޓްރޭޓް ސޮލިއުޝަން އިން 4 މިނެޓް ސްޓޭން ކުރާށެވެ. މި އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯގްރާފްތައް ނަގާފައިވަނީ ކެމެރާ ވަންވިއު 4ކޭ 16 ބިޓް (ގަޓަން) އާއި ޑިޖިޓަލްމައިކްރޯގްރާފް ސޮފްޓްވެއާ (ގަޓަން) އާއި އެކު ޖޭއީއެމް-2100 ޕްލަސް ޓްރާންސްމިޝަން އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯސްކޯޕް (ޖީއީއޯއެލް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ތަޙުލީލުކުރުމަށްޓަކައި އިލެކްޓްރޯން މައިކްރޯގްރާފްތައް ހޯދާފައިވަނީ 5000× ނުވަތަ 10،000× ޑިޖިޓަލް ޒޫމް އިންނެވެ.
މައިޓޮކޮންޑްރިއާގެ މޯރފޮލޮޖިކަލް އެނަލިސިސް. ހުރިހާ ތަޙުލީލުތަކަށް ވެސް، އިމޭޖްޖޭ ސޮފްޓްވެއާ ބޭނުންކޮށްގެން ޑިޖިޓަލް އިމޭޖްތަކުގައި ވަކިވަކި މައިޓޮކޮންޑްރިއާތަކުގެ ކޮންޓޯރސް މެނުއަލްކޮށް ފާހަގަކޮށްފައިވެއެވެ. ތަފާތު މޯރފޮލޮޖިކަލް ޕެރަމިޓަރުތައް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވެއެވެ. މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް ޑެންސިޓީ ހާމަކުރަނީ ކޮންމެ ސެލްއެއްގެ ޖުމްލަ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އޭރިއާ ސައިޓޯޕްލާސްމް އޭރިއާ (ސައިޓޯޕްލާސްމް އޭރިއާ = ސެލް އޭރިއާ-ސެލް ނިއުކްލިއަސް އޭރިއާ) × 100 އަށް ބަހާލައިގެން ލިބޭ ޕަސެންޓެއްގެ ގޮތުގައެވެ. މައިޓޮކޮންޑްރިއާގެ އިސްޓާ މޯރފޮލޮޖީ ތަޙުލީލުކޮށް، އެތަކެތީގެ މައިގަނޑު ބައްޓަމަށް ބަލާފައި ދެ ކެޓަގަރީއަކަށް (“ޓިއުބިއުލަރ” އަދި “ބްލިސްޓަރ”) ބަހާފައިވެއެވެ.
އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމް ނަންބަރާއި ޑެންސިޓީ ތަޙުލީލުކުރުން. ޑިޖިޓަލް އިމޭޖްގައިވާ ކޮންމެ އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމްގެ ކޮންޓޯރސް މެނުއަލްކޮށް އައުޓްލައިން ކުރުމަށް އިމޭޖްޖޭ ސޮފްޓްވެއަރ ބޭނުންކުރުން. އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމް އޭރިއާ ހާމަކުރަނީ ކޮންމެ ސެލްއެއްގެ ޖުމްލަ އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމް ސްޓްރަކްޗަރ އޭރިއާ ސައިޓޯޕްލާސްމް އޭރިއާ (ސައިޓޯޕްލާސްމް އޭރިއާ=ސެލް އޭރިއާ-ނިއުކްލިއަސް އޭރިއާ)×100 އަށް ބަހާލައިގެން ގުނާ ޕަސެންޓެއްގެ ގޮތުގައެވެ. އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމްގެ ޑެންސިޓީ ހޯދަނީ ޖުމްލަ އަދަދު ސެލްއަކަށް އޮޓޯފޭގޯސޯމް/ލައިސޯސޯމް ސްޓްރަކްޗަރސްގެ އަދަދަށް ބަހާލައިގެން (ސައިޓޯޕްލާސްމިކް އޭރިއާގެ ގޮތުން) (ސައިޓޯޕްލާސްމިކް އޭރިއާ = ސެލް އޭރިއާ-ނިއުކްލިއަރ އޭރިއާ) އެވެ.
އެކިއުޓް ސެކްޝަނިންގ އާއި ސާމްޕަލް ތައްޔާރުކުރުމަށް ލޭބަލްކުރުން. ގްލޫކޯޒް ލޭބަލިންގ ބޭނުންވާ ތަޖުރިބާތަކަށް، ސީރިއަސް ސިކުނޑީގެ ސްލައިސްތައް ޕްރީ އިންކިއުބޭޝަން ޗެމްބަރަކަށް ބަދަލުކޮށް، ސެޗުރޭޓެޑް ކާބަން (95% O2 އަދި 5% CO2)، ހައި Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ސޯޑިއަމް ފޮސްފޭޓް ބަފަރ، 25.0 mM NaHCO 3، 25.0 mM ހިމެނޭ ޗެމްބަރަކަށް ބަދަލުކުރުން d-glucose، 1.0 mM CaCl 2 އަދި 2.0 mM MgCl 2، pH 7.4 އަދި 310 އިން 320 mOsm އަށް އެޖެސްޓްކޮށްފައި، އޭގައި ގްލޫކޯޒް އަކީ 13 C 6- ގްލޫކޯޒް ބަދަލުކުރުން (Eurisotop، ކެޓަލަގް ނަންބަރު CLM-1396) އެވެ. ޕައިރޫވޭޓް ލޭބަލިންގ ބޭނުންވާ ތަޖުރިބާތަކަށް، ސީރިއަސް ސިކުނޑީގެ ސްލައިސްތައް މަތީ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ސޯޑިއަމް ފޮސްފޭޓް ބަފަރ، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 1.0 mM CaCl2 އަދި 2.0mM އިތުރުކުރުން) އަށް ބަދަލުކުރުން MgCl2، ޕީއެޗް 7.4 އަދި 310 އިން 320mOsm އަށް އެޖެސްޓްކޮށް، 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, catalog number CLM-1082) އަޅާށެވެ. މި ބައިތައް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 90 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. މި ތަޖުރިބާ ނިމުމުން 75 އެމްއެމް އެމޯނިއަމް ކާބޮނެޓް ހިމެނޭ ފެން ސޮލިއުޝަނެއް (ޕީއެޗް 7.4) އިން ސެކްޝަންތައް އަވަހަށް ދޮވެ، އޭގެ ފަހުން 40:40:20 (v:v:v) އެސިޓޮނިޓްރައިލް (ACN): މެތަނަލް: ފެނުގައި ހޯމޯޖެނައިޒް ކުރިއެވެ. މި ބައިތައް އައިސް މަތީގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން ބެހެއްޓުމަށްފަހު، ސާމްޕަލްތައް 21،000 ގްރާމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖްކޮށް، ސާފު ސުޕަރނެޓެންޓް ސްޕީޑްވެކް ކޮންސެންޓްރޭޓަރެއްގައި ހިއްކާފައިވެއެވެ. ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ހިކި މެޓަބޮލައިޓް ޕެލެޓް ތަޙުލީލު ކުރެވެންދެން -80 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ރައްކާކޮށްފައިވެއެވެ.
ސީ ލޭބަލް ކުރެވިފައިވާ 13 އެމިނޯ އެސިޑްގެ ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ-މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީ އެނަލިސިސް. ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ-މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީ (އެލްސީ-އެމްއެސް) އެނަލިސިސް އަށް މެޓަބޮލައިޓް ޕެލެޓް 75μl އެލްސީ-އެމްއެސް ގްރޭޑް ވޯޓަރ (ހަނީވެލް) ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑް ކުރިއެވެ. 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 21،000 ގްރާމްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިގޭޓް ކުރުމަށްފަހު، ކްލެރިފައިޑް ސުޕަރނެޓެންޓްގެ 20 μl އެމިނޯ އެސިޑް ފްލަކްސް އެނަލިސިސްއަށް ބޭނުންކުރިއިރު، ބާކީ ހުރި އެކްސްޓްރެކްޓް ވަގުތުން އެނިއަން އެނަލިސިސްއަށް ބޭނުންކުރިއެވެ (ތިރީގައި ބަލާށެވެ). އެމިނޯ އެސިޑް އެނަލިސިސް ހެދީ ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ބެންޒޮއިލް ކްލޮރައިޑް ޑެރިވޭޓައިޒޭޝަން ޕްރޮޓޮކޯލް (55، 56) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ފުރަތަމަ ފިޔަވަހީގައި 20μl މެޓަބޮލައިޓް އެކްސްޓްރެކްޓަށް 10μl 100 mM ސޯޑިއަމް ކާބޮނެޓް (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) އެޅުމަށްފަހު، އެލްސީ ގްރޭޑް އޭސީއެން އަށް 10μl %2 ބެންޒޮއިލް ކްލޮރައިޑް (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) އެޅިއެވެ. މި ސާމްޕަލް ކުރު މުއްދަތަކަށް ވޯރޓެކްސް ކޮށްލުމަށްފަހު 21،000 ގްރާމްގައި 20 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. ކްލިއަރ ކޮށްފައިވާ ސުޕަރނެޓެންޓް ކޮނިކަލް ގްލާސް އިންސަރޓް (200 μl ވޮލިއުމް) އެއް އެކުލެވޭ 2 މިލިލީޓަރުގެ އޮޓޯސެމްޕްލަރ ވައިއަލް އަކަށް ބަދަލުކުރުން. މި ސާމްޕަލްތައް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ ކިއު-އެކްސެކްޓިވް (ކިއުއީ)-އެޗްއެފް (އަލްޓްރާ ހައި ފީލްޑް އޯބިޓްރެޕް) ހައި ރިޒޮލިއުޝަން ޕްރެސިޝަން މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އާއި ގުޅިފައިވާ އެކިއުޓީ އައިކްލާސް އަލްޓްރާ ހައި ޕާފޯމަންސް އެލްސީ ސިސްޓަމް (ވޯޓަރސް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ތަޙުލީލުކުރުމަށްޓަކައި ޑެރިވޭޓައިޒްޑް ސާމްޕަލްގެ 2μl 1.8μm ޕާރޓިކަލްސް ހިމެނޭ 100×1.0 އެމްއެމް ހައި ސްޓްރެންތް ސިލިކާ ޓީ3 ކޮލަމް (ވޯޓަރސް) އަކަށް އިންޖެކްޓް ކުރިއެވެ. ފްލޯ ރޭޓަކީ 100μl/min ކަމަށާއި، ބަފަރ ސިސްޓަމްގައި ހިމެނެނީ ބަފަރ އޭ (10 mM އެމޯނިއަމް ފޯމެޓް އަދި ފެނުގައި 0.15% ފޯމިކް އެސިޑް) އާއި ބަފަރ ބީ (ACN) އެވެ. ގްރޭޑިއަންޓް ތިރީގައި މިވަނީއެވެ: 0 މިނެޓްގައި 0%B؛ 0%ބީ. 0 އިން 0.1 މިނެޓުގައި 0 އިން 15% ބީ؛ 0.1 އިން 0.5 މިނެޓުގައި 15 އިން 17% ބީ؛ ބީ 0.5 އާއި 14 މިނެޓުގައި %17 އާއި %55 އާއި ދެމެދުގެ މިންވަރަކަށް؛ ބީ 14 އާއި 14.5 މިނެޓުގައި %55 އާއި %70 އާއި ދެމެދުގެ މިންވަރަކަށް؛ 18 މިނެޓުގައި 14.5 އިން 70 އިން 100% ބީ ގައި؛ 18 އިން 19 މިނެޓަށް 100% ބީ؛ 19 އިން 19.1 މިނެޓުގައި 100 އިން 0% ބީ؛ 19.1 އިން 28 މިނެޓަށް %0 ބީ (55، 56) އެވެ. ކިއުއީ-އެޗްއެފް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރު އޮޕަރޭޓް ކުރަނީ ޕޮޒިޓިވް އަޔަނައިޒޭޝަން މޯޑުގައި މާސް ރޭންޖް އެމް/ޒެޑް (މާސް/ޗާޖް ރޭޝިއޯ) 50 އާއި 750 އާއި ދެމެދުގެ މިންވަރެއްގައެވެ. ހީޓްޑް އިލެކްޓްރޯސްޕްރޭ އަޔަނައިޒޭޝަން (އީއެސްއައި) ސޯސް އޮޕަރޭޓް ކުރަނީ 3.5 ކިލޯވޮޓްގެ ސްޕްރޭ ވޯލްޓޭޖް، ކެޕިލަރީ ޓެމްޕަރޭޗަރ 250 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް، ޝީތު އެއަރފްލޯ 60 އޭޔޫ (އާބިޓްރަރީ ޔުނިޓްސް) އަދި 20 އޭޔޫގެ އެހީތެރި އެއަރފްލޯގައެވެ. 250 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އެވެ. އެސް ލެންސް ސެޓްކޮށްފައިވަނީ 60 އޭޔޫ އަށެވެ.
އެނިއަން ކްރޮމެޓޮގްރަފީ-އެމްއެސް އެނަލިސިސް އޮފް 13ސީ ލޭބަލްޑް އޯގަނިކް އެސިޑް. ބާކީ ހުރި މެޓަބޮލައިޓް ޕްރެސިޕިޓޭޓް (55μl) ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ ކިއުއީ-އެޗްއެފް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އާއި ގުޅިފައިވާ ޑައިއޮނެކްސް އަޔަން ކްރޮމެޓޮގްރަފީ ސިސްޓަމް (ICS 5000+، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، 1. )on ގެ ފިލްލިންގ ރޭޝިއޯއެއްގައި ޕުޝް-އިން ޕާރޝިއަލް ލޫޕް މޯޑުގައި އެޗްޕީއެލްސީ (2 އެމްއެމް×250 އެމްއެމް، ޕާރޓިކަލް ސައިޒް 4μm، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އާއި އެކު ޑައިއޮނެކްސް އަޔަންޕެކް އޭއެސް11-އެޗްސީ ކޮލަމަކަށް 5μl މެޓަބޮލައިޓް އެކްސްޓްރެކްޓް އިންޖެކްޓް ކުރިއެވެ. ޑައިއޮނެކްސް އަޔަންޕެކް އޭޖީ11-އެޗްސީ ގާޑް ކޮލަމް (2 އެމްއެމް x 50 އެމްއެމް، 4μm، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އެވެ. ކޮލަމްގެ ފިނިހޫނުމިން 30 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ބެހެއްޓުމަށްފަހު، އޮޓޯސެމްޕްލަރ 6 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަށް ސެޓްކޮށްފައިވެއެވެ. އިލޫއެންޓް ޖަނަރޭޓަރ މެދުވެރިކޮށް ޕޮޓޭސިއަމް ހައިޑްރޮކްސައިޑް ގްރޭޑިއަންޓެއް އުފެއްދުމަށްޓަކައި ޑީއަޔަނައިޒްޑް ފެނާއި އެކު ޕޮޓޭސިއަމް ހައިޑްރޮކްސައިޑް ކާޓްރިޖެއް ބޭނުންކުރުން. 380μl/min ގެ ފްލޯ ރޭޓެއްގައި މެޓަބޮލައިޓްތައް ވަކިކުރުން، ތިރީގައިވާ ގްރޭޑިއަންޓް ޖަހައިގެން: 0 އިން 3 މިނެޓަށް، 10 mM KOH؛ 3 އިން 12 މިނެޓަށް، 10 އާއި 50 އެމްއެމް ކޭއޯއެޗް؛ 12 އާއި 19 މިނެޓް، 50 އާއި 100 އެމްއެމް ކޭއޯއެޗް؛ 19 އިން 21 މިނެޓަށް , 100 mM KOH; 21 އާއި 21.5 މިނެޓާއި ދެމެދުގެ މިންވަރަކަށް 100 އާއި 10 އެމްއެމް ކޭއޯއެޗް އެވެ. މި ކޮލަމް 10 އެމްއެމް ކޭއޯއެޗްގެ ދަށުން 8.5 މިނެޓް ވަންދެން އަލުން އިކުއިލިބްރޭޓް ކުރިއެވެ.
އެލިއުޓް ކުރެވިފައިވާ މެޓަބޮލައިޓްތައް ކޮލަމްގެ ފަހުން 150μl/min ގެ އައިސޯޕްރޮޕެނަލް ސަޕްލިމެންޓް ސްޓްރީމް އާއި އެއްކޮށްލުމަށްފަހު ނެގެޓިވް އަޔަނައިޒޭޝަން މޯޑުގައި އޮޕަރޭޓްކުރާ ހައި ރިޒޮލިއުޝަން މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރަކަށް ގެންދެއެވެ. އެމްއެސް އިން ދަނީ 60،000 ގެ ރިޒޮލިއުޝަނަކާއެކު m/z 50 އިން 750 އަށް މާސް ރޭންޖް މޮނިޓަރ ކުރަމުންނެވެ. އޭޖީސީ ސެޓްކޮށްފައިވަނީ 1×106 އަށް ކަމަށާއި، އެންމެ ގިނަ އަޔަން ޓައިމް ބެހެއްޓޭނީ 100 މިލިސެންޓްގައެވެ. ހޫނުކޮށްފައިވާ އީއެސްއައި ސޯސް އޮޕަރޭޓް ކޮށްފައިވަނީ 3.5 ކިލޯވޮޓްގެ ސްޕްރޭ ވޯލްޓޭޖެއްގައެވެ. އަޔަން ސޯސްގެ އެހެން ސެޓިންގްސްތައް ތިރީގައި މިވަނީއެވެ: ކެޕިލަރީ ޓެމްޕަރޭޗަރ 275 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް؛ ޝީތު ގޭސް ފްލޯ، 60 އޭޔޫ؛ އެހީތެރި ގޭސް ފްލޯ، 300 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 20 އޭޔޫ، އަދި އެސް ލެންސް 60 އޭޔޫ އަށް ސެޓްކުރުން.
13C ލޭބަލް ކުރެވިފައިވާ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ޑޭޓާ އެނަލިސިސް. އައިސޮޓޯޕް ރޭޝިއޯގެ ޑޭޓާ ތަޙުލީލުކުރުމަށް ޓްރޭސްފައިންޑަރ ސޮފްޓްވެއަރ (ވަރޝަން 4.2، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކުރުން. ކޮންމެ ކޮމްޕައުންޑެއްގެ އައިޑެންޓިޓީ އިތުބާރު ހުރި ރެފަރެންސް ކޮމްޕައުންޑަކުން ޔަގީންކޮށް، މިނިވަންކަމާއެކު ތަހުލީލުކޮށްފައިވެއެވެ. އައިސޮޓޯޕް އެންރިޗްމަންޓް އެނަލިސިސް ހެދުމަށްޓަކައި، ކޮންމެ 13C އައިސޮޓޯޕް (Mn) ގެ އެކްސްޓްރެކްޓްޑް އަޔަން ކްރޮމެޓޯގްރާމް (XIC) ގެ އޭރިއާ [M + H] + އިން ނެގިއިރު، n އަކީ ޓާގެޓް ކޮމްޕައުންޑްގެ ކާބަން ނަންބަރެވެ. އެކްސްއައިސީގެ މާސް އެކިއުރެސީ އަކީ މިލިއަނަކަށް ފަސް ބައިއަށްވުރެ މަދު އެއްޗެއް ކަމަށާއި، އާރްޓީގެ އެކިއުރެސީ އަކީ 0.05 މިނެޓެވެ. އެންރިޗްމަންޓް އެނަލިސިސް ހެދެނީ ހޯދިފައިވާ ކޮންމެ އައިސޮޓޯޕެއްގެ ނިސްބަތާއި އެ ކޮމްޕައުންޑެއްގެ ހުރިހާ އައިސޮޓޯޕްތަކެއްގެ ޖުމްލަ ހިސާބުކޮށްގެންނެވެ. މި ނިސްބަތްތައް ކޮންމެ އައިސޮޓޯޕަކަށް ޕަސެންޓޭޖް ވެލިއުތަކެއްގެ ގޮތުގައި ދީފައިވާއިރު، ނަތީޖާތައް ހާމަކޮށްފައިވަނީ ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން މޮލާރ ޕަސެންޓް އެންރިޗްމަންޓް (އެމްޕީއީ) ގެ ގޮތުގައެވެ (42).
ފްރޯޒެން ނިއުރޯން ޕެލެޓް އައިސް ކޯލްޑް 80% މެތަނަލް (v/v) ގައި ހޯމޯޖެނައިޒްކޮށް، ވޯރޓެކްސްކޮށް، -20 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. އަނެއްކާވެސް ސާމްޕަލް ވޯރޓެކްސްކޮށް +4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން ހޫނުކޮށްލާށެވެ. މި ސާމްޕަލް 21،000 ގްރާމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ލިބުނު ސުޕަރނެޓެންޓް އެއްކޮށް 25 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ސްޕީޑްވެކް ކޮންސެންޓްރޭޓަރ ބޭނުންކޮށްގެން ހިއްކައިގެން ފަހުން ތަޙުލީލުކޮށްފައިވެއެވެ. މަތީގައި ބަޔާންކުރެވުނު ފަދައިން ސޯރޓް ކުރެވުނު ސެލްތަކުގެ އެމިނޯ އެސިޑްތަކުގެ މައްޗަށް އެލްސީ-އެމްއެސް އެނަލިސިސް ހެދިއެވެ. ޓްރޭސްފައިންޑަރ (ވަރޝަން 4.2، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކޮށްގެން ޑޭޓާ އެނަލިސިސް ހެދީ ކޮންމެ ކޮމްޕައުންޑެއްގެ މޮނޮއައިސޮޓޮޕިކް މާސް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. މެޓަބޮލައިޓް ޑޭޓާގެ ކުއަންޓައިލް ނޯމަލައިޒޭޝަން ހެދީ ޕްރީޕްރޮސެސްކޯރ ސޮފްޓްވެއަރ ޕެކޭޖް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ (57).
ސްލައިސް ތައްޔާރުކުރުން. މައުސް އަވަހަށް ކާބަން ޑައިއޮކްސައިޑް އިން ހޭނައްތާލައި ބޯ ކަނޑާލައި، ސިކުނޑި އަވަހަށް ބޮލުގެ ނާށިގަނޑުން ނަގައި، އައިސް ފުރިފައިވާ ވައިބަރޭޓިން ވަޅި (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ބޭނުންކޮށްގެން 300 އާއި 375 μm އާއި ދެމެދުގެ ސެޖިޓަލް ސެކްޝަންތަކަށް ކަނޑާލިއެވެ Cold carbon gasification (95% O2 and 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ސޯޑިއަމް ފޮސްފޭޓް ބަފަރ، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 1.0 mM CaCl2 އަދި 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 އަދި 310 އިން 330 mOsm އަށް އެޖެސްޓްކުރުން). ލިބިފައިވާ ސިކުނޑީގެ ސްލައިސްތައް ގިނަ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ސޯޑިއަމް ފޮސްފޭޓް ބަފަރ، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 4.0 mM CaCl2 އަދި mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 އަދި mM 3.5 MgCl2 ހިމެނޭ ޗެމްބަރަކަށް ބަދަލުކުރުން 310 އިން 320 އެމްއޯއެސްއެމް) އެވެ. ރެކޯޑް ކުރުމުގެ ކުރިން ސްލައިސްތައް އަލުން އާލާކުރެވޭނެ ގޮތަށް 20 އާއި 30 މިނެޓާ ދެމެދުގެ މުއްދަތަކަށް ސްލައިސްތައް ރައްކާކުރާށެވެ.
ރެކޯޑިންގ އެވެ. ހުރިހާ ރެކޯޑިންތަކަށް ވެސް ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ ފިކްސްޑް ރެކޯޑިން ޗެމްބަރަކާއި 20x ވޯޓަރ އިމަރޖެންސް އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސް (ސައިންޓިފިކާ) އެއް ޖަހާފައިވާ މައިކްރޯސްކޯޕް ސްޓޭޖެވެ. ޕިއުޓޭޓިވް ޕަރކިންޖޭ ސެލްތައް ދެނެގަނެވުނީ (i) ހަށިގަނޑުގެ ސައިޒާއި، (ii) ސެރެބެލަމްގެ އެނަޓޮމިކަލް ލޮކޭޝަން އަދި (iii) ފްލޫރެސްސެންޓް mtYFP ރިޕޯޓަރ ޖީންގެ އެކްސްޕްރެޝަން އިންނެވެ. 5 އާއި 11 މެގޯމް އާއި ދެމެދުގެ ޓިޕް ރެސިސްޓެންސް އެއް ހުންނަ ޕެޗް ޕިޕެޓް ދަމައިގަންނަނީ ބޮރޯސިލިކޭޓް ގްލާސް ކެޕިލަރީ (ޖީބީ150-10، 0.86 އެމްއެމް×1.5 އެމްއެމް×100 އެމްއެމް، ސައިންސް ޕްރޮޑަކްޓްސް، ހޮފްހައިމް، ޖަރުމަން) އާއި ހޮރައިޒޮންޓަލް ޕިޕެޓް އިންސްޓްރޫމެންޓްސް (ޕީ-1000، ސަޓަރ)، ނޮވާޓޯ، ސީއޭ އިންނެވެ. ހުރިހާ ރެކޯޑިންތަކެއް ވެސް ހެދީ ސޮފްޓްވެއާ ސިގްނަލް (ވަރޝަން 6.0، ކެމްބްރިޖް އިލެކްޓްރޯނިކް، ކެމްބްރިޖް، ޔޫކޭ) އިން ކޮންޓްރޯލް ކުރި ELC-03XS npi ޕެޗް ކްލެމްޕް އެމްޕްލިފައިޓަރ (npi electronic GmbH, Tam, Germany) އިންނެވެ. މި ތަޖުރިބާ ރެކޯޑްކޮށްފައިވަނީ 12.5 ކިލޯ ހެޒްގެ ސާމްޕަލް ރޭޓެއްގައެވެ. މި ސިގްނަލް ފިލްޓަރ ކުރަނީ 1.3 އަދި 10 ކިލޯ ހެޒްގެ ކަޓޯފް ފްރީކުއެންސީތަކެއް ހުންނަ ދެ ޝޯޓް ޕާސް ބެސެލް ފިލްޓަރަކުންނެވެ. މެމްބަރޭން އާއި ޕިޕެޓްގެ ކެޕޭސިޓެންސް ކޮމްޕެންސޭޓް ކުރަނީ އެމްޕްލިފައިޓަރ ބޭނުންކޮށްގެން ކޮމްޕެންސޭޝަން ސާރކިއުޓް އިންނެވެ. ހުރިހާ ތަޖުރިބާތަކެއް ވެސް ކޮށްފައިވަނީ ހޮކާވޯ ސޮފްޓްވެއާ (ވަރޝަން 2.8، ހަމާމަޓްސޫ، ގޭރޑަން، ޖަރުމަން) އިން ކޮންޓްރޯލް ކުރެވިފައިވާ އޯކާ-ފްލެޝް 4.0 ކެމެރާ (ހަމަމަޓްސޫ، ގޭރޑަން، ޖަރުމަން) ގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުންނެވެ.
ރޫޓިން ހޯލް-ސެލް ކޮންފިގްރޭޝަން އަދި އެނަލިސިސް. ރެކޯޑް ކުރުމުގެ ވަގުތުން ކުރިން ޕިޕެޓްގައި ތިރީގައިވާ މާއްދާތައް ހިމެނޭ އެތެރޭގެ ސޮލިއުޝަން ފުރާލާށެވެ: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM ޕޮޓޭސިއަމް ގްލޫކޮނެޓް، 10.0 mM Hepes، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) އަދި 10.0 އެމްއެމް ކްރިއޭޓިނިން ފޮސްފޭޓް ޕީއެޗް 7.25 އަށް އެޖެސްޓްކޮށްފައިވާއިރު، އޮސްމޮޓިކް ޕްރެޝަރު ހުރީ 290 އެމްއޯއެސްއެމް (ސުކްރޯޒް) އަށެވެ. 0 ޕީއޭ ގެ ބާރެއް ޖަހައިގެން މެމްބަރޭން ފަޅައިގެން ދިއުމަށްފަހު ވަގުތުން އަރާމުކުރާ މެމްބަރޭން ޕޮޓެންޝަލް ވަޒަންކުރިއެވެ. އިންޕުޓް ރެޒިސްޓެންސް މިންކުރަނީ -40، -30، -20، އަދި -10 ޕީއޭ ގެ ހައިޕަރޕޮލަރައިޒްޑް ކަރަންޓް ޖަހައިގެންނެވެ. ވޯލްޓޭޖް ރެސްޕޮންސްގެ މެގްނިޓިއުޑް މިންކޮށް، އިންޕުޓް ރެޒިސްޓެންސް ހޯދުމަށް އޯމްސް ލޯ ބޭނުންކުރުން. ވޯލްޓޭޖް ކްލެމްޕެއްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން އަމިއްލައަށް ހިނގާ ހަރަކާތްތައް ރެކޯޑްކޮށް، ސެމީ އޮޓޮމެޓިކް ރިކޮގްނިޝަން ސްކްރިޕްޓެއް ބޭނުންކޮށްގެން އިގޯރ ޕްރޯ (ވަރޝަން 32 7.01، ވޭވްމެޓްރިކްސް، ލޭކް އޮސްވެގޯ، އޮރެގަން، ޔޫ.އެސް.އޭ) ގައި sPSC ދެނެގަނެ މިންކުރިއެވެ. އައިވީ ކަރވް އަދި ސްޓޭޑި-ސްޓޭޓް ކަރަންޓް ވަޒަންކުރަނީ ބެޓެރީ ތަފާތު ޕޮޓެންޝަލްތަކުގައި (-110 އެމްވީ އިން ފެށިގެން) ކްލެމްޕްކޮށް، 5 އެމްވީ ފިޔަވަޅުތަކެއްގައި ވޯލްޓޭޖް އިތުރުކޮށްގެންނެވެ. އޭޕީ އުފެއްދުން ޓެސްޓްކޮށްފައިވަނީ ޑިޕޮލަރައިޒިންގ ކަރަންޓެއް ޖަހައިގެންނެވެ. ޑިޕޮލަރައިޒިންގ ކަރަންޓް ޕަލްސް އެއް ޖަހަމުން -70 އެމްވީ ގައި ސެލް ކްލެމްޕް ކުރާށެވެ. ކޮންމެ ރެކޯޑިންގ ޔުނިޓެއްގެ ސްޓެޕް ސައިޒް ވަކިވަކިން (10 އިން 60 ޕީއޭ) އެޖެސްޓްކުރުން. އެންމެ ގިނައިން އޭޕީ ފްރީކުއެންސީ އުފެދޭ ޕަލްސް ސްޕައިކްސް މެނުއަލްކޮށް ގުނާފައި މެކްސިމަމް އޭޕީ ފްރީކުއެންސީ ހިސާބުކުރުން. އޭޕީ ތްރެޝްހޯލްޑް ތަޙުލީލުކުރަނީ ފުރަތަމަ އެއް ނުވަތަ އެއަށްވުރެ ގިނަ އޭޕީ ޓްރިގަރ ކުރާ ޑިޕޮލަރައިޒޭޝަން ޕަލްސްގެ ދެވަނަ ޑެރިވޭޓިވް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
ޕަރފޯރޭޓެޑް ޕެޗް ކޮންފިގްރޭޝަން އަދި އެނަލިސިސް. ސްޓޭންޑަރޑް ޕްރޮޓޮކޯލްތައް ބޭނުންކޮށްގެން ޕަރފޯރޭޓެޑް ޕެޗް ރެކޯޑިންގ ހެދުން. ތިރީގައިވާ މާއްދާތައް ނުހިމެނޭ އޭޓީޕީ އަދި ޖީޓީޕީ ފްރީ ޕިޕެޓެއް ބޭނުންކުރުން: 128 އެމްއެމް ގްލޫކޮނެޓް ކޭ، 10 އެމްއެމް ކޭސީއެލް، 10 އެމްއެމް ހެޕެސް، 0.1 އެމްއެމް އީޖީޓީއޭ އަދި 2 އެމްއެމް އެމްޖީސީއެލް2، އަދި ޕީއެޗް 7.2 އަށް އެޖެސްޓްކުރުން (ކޭއޯއެޗް ބޭނުންކޮށްގެން). ސެލް މެމްބަރޭންގެ ކޮންޓްރޯލް ނުކުރެވި ޕާމިއޭބިލިޓީ ހުއްޓުވުމަށްޓަކައި އިންޓްރާސެލިއުލަރ ސޮލިއުޝަން އިން އޭޓީޕީ އާއި ޖީޓީޕީ އުނިކުރެވެއެވެ. ޕެޗް ޕިޕެޓް ފުރިފައިވަނީ އެމްފޮޓެރިސިން ހިމެނޭ އެތެރޭގެ ސޮލިއުޝަނެއް (ގާތްގަނޑަކަށް 200 އާއި 250 μg/ml؛ G4888، Sigma-Aldrich) އިން ލޯވަޅު އަޅާފައިވާ ޕެޗްގެ ރެކޯޑެކެވެ. އެމްފޮޓެރިސިން ޑައިމެތައިލް ސަލްފޮކްސައިޑް (ފައިނަލް ކޮންސެންޓްރޭޝަން: 0.1 އިން 0.3%؛ ޑީއެމްއެސްއޯ؛ ޑީ8418، ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) ގައި ގިރާފައިވެއެވެ. ބޭނުންކުރި ޑީއެމްއެސްއޯގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަންގެ ސަބަބުން ދިރާސާކުރި ނިއުރޯންތަކަށް މާބޮޑު އަސަރެއް ނުކުރި އެވެ. ޕަންޗިންގ ޕްރޮސެސްގެ ތެރޭގައި ޗެނަލް ރެސިސްޓެންސް (Ra) މެދުނުކެނޑި މޮނިޓަރކޮށް، ތަޖުރިބާ ފެށީ ރާ އާއި އޭޕީގެ އެމްޕްލިޓިއުޑް ސްޓޭބަލްވުމަށްފަހު (20-40 މިނެޓް) އެވެ. އަމިއްލައަށް ހިނގާ ހަރަކާތްތައް މިންކުރަނީ ވޯލްޓޭޖް އަދި/ނުވަތަ ކަރަންޓް ކްލެމްޕެއްގައި 2 އާއި 5 މިނެޓާއި ދެމެދުގެ މުއްދަތަކަށެވެ. ޑޭޓާ އެނަލިސިސް ހެދީ އިގޯރ ޕްރޯ (ވަރޝަން 7.05.2، ވޭވްމެޓްރިކްސް، ޔޫ.އެސް.އޭ)، އެކްސެލް (ވަރޝަން 2010، މައިކްރޮސޮފްޓް ކޯޕަރޭޝަން، ރެޑްމަންޑް، ޔޫ.އެސް.އޭ) އަދި ގްރާފްޕެޑް ޕްރިޒަމް (ވަރޝަން 8.1.2، ގްރާފްޕެޑް ސޮފްޓްވެއަރ އިންކް، ލާ ޖޮލާ، ސީ.އޭ) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެމެރިކާ). އަމިއްލައަށް އުފެދޭ އޭޕީތައް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި އިގޯރޕްރޯގެ ނިއުރޯމެޓިކް v3.0c ޕްލަގް-އިން ބޭނުންކުރެއެވެ. ކޮންމެ ރެކޯޑަކަށް ވަކިވަކިން އެޖެސްޓް ކުރެވޭ، ދީފައިވާ ތެރެސްހޯލްޑެއް ބޭނުންކޮށްގެން އޭޕީތައް އޮޓޮމެޓިކުން ދެނެގަތުން. ސްޕައިކް އިންޓަވަލް ބޭނުންކޮށްގެން މެކްސިމަމް އިންސްޓަންޓޭނިއަސް ސްޕައިކް ފްރީކުއެންސީ އާއި އެވްރެޖް ސްޕައިކް ފްރީކުއެންސީ އާއި އެކު ސްޕައިކް ފްރީކުއެންސީ ކަނޑައެޅުން.
ޕީއެން އައިސޮލޭޝަން. ކުރިން ޝާއިޢުކުރެވުނު ޕްރޮޓޮކޯލަށް އެޑެޕްޓްވެ، ޕީއެންސްތައް މައުސް ސެރެބެލަމް އިން ކަނޑައެޅިފައިވާ މަރުޙަލާއެއްގައި ޕިއުރިފައި ކުރެވުނެވެ ( 58 ). ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، ސެރެބެލަމް ޑިސެކްޓްކޮށް އައިސް ކޯލްޑް ޑިސޮސިއޭޝަން މީޑިއަމްގައި [އެޗްބީއެސްއެސް Ca2+ އަދި Mg2+ ނުހިމެނޭ، 20 އެމްއެމް ގްލޫކޯޒް، ޕެނިސިލިން (50 ޔޫ/އެމްއެލް) އަދި ސްޓްރެޕްޓޮމައިސިން (0.05 މިލިގްރާމް/ މިލިލީޓަރު) އިން ސަޕްލިމެންޓްކޮށްފައި]، އޭގެ ފަހުން ޕެޕައިން [އެޗްބީއެސްއެސް، 1-ސިސްޓައިން·އެޗްސީއެލް އިން ސަޕްލިމެންޓްކޮށްފައިވާ] މީޑިއަމް ހަޖަމުކުރިއެވެ (1 މިލިގްރާމް / މިލިލީޓަރު)، ޕެޕެއިން (16 ޔޫ / މިލިލީޓަރު) އަދި ޑިއޮކްސީރައިބޮނިއުކްލިއޭޒް އައި (ޑީއެންއޭޒް އައި؛ 0.1 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް)] 30 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން ފަރުވާ ދޭށެވެ. ފުރަތަމަ އެންޒައިމެޓިކް ހަޖަމުވުން ހުއްޓުވުމަށްޓަކައި ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި ބިސް މީޔުކަސް (10 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް)، ބީއެސްއޭ (10 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް) އަދި ޑީއެންއޭޒް (0.1 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް) ހިމެނޭ އެޗްބީއެސްއެސް މީޑިއަމްގައި ދޮވެ، ދެން 20 އެމްއެމް ގްލޫކޯޒް ހިމެނޭ އެޗްބީއެސްއެސް މީޑިއަމްގައި އެޗްބީއެސްއެސް، ޕެނިސިލިން (50 ޔޫ/އެމްއެލް)، ސްޓްރެޕްޓޮމައިސިން (0.05 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް) އަދި މަޑުމަޑުން ގިރާލާށެވެ ޑީއެންއޭޒް (0.1 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް) އިން އެއް ސެލް ދޫކުރެއެވެ. ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ސެލް ސަސްޕެންޝަން 70μm ސެލް ސްޓްރޭނަރ އެއް މެދުވެރިކޮށް ފިލްޓަރކޮށް، ދެން ސެލްތައް ސެންޓްރިފިގޭޝަން (1110 rpm، 5 މިނެޓް، 4°C) އިން ޕެލެޓްކޮށް ސޯރޓިންގ މީޑިއަމް [HBSS، 20 mM ގްލޫކޯޒް، 20% ފީޓަލް ބޮވައިން ) ސީރަމް، ޕެނިސިލިން (50 U/ml) އަދި ސްޓްރެޕްޓޮމައިސިން އާއި އެކު ރީސަސްޕެންޑް ކުރިއެވެ (0.05 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް)]؛ ޕްރޮޕިޑިއަމް އަޔޮޑައިޑް އިން ސެލް ވައިއޭބިލިޓީ ވަޒަންކޮށް ސެލް ޑެންސިޓީ 1×106 އިން 2×106 ސެލްސް/އެމްއެލް އަށް އެޖެސްޓްކުރުން. ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީގެ ކުރިން ސަސްޕެންޝަން ފިލްޓަރ ކޮށްފައިވަނީ 50 μm ގެ ސެލް ސްޓްރޭނަރ އެއް މެދުވެރިކޮށެވެ.
ފްލޯ ސައިޓޯމީޓަރެވެ. ސެލް ސޯރޓިންގ ހެދީ 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި FACSAria III މެޝިން (BD Biosciences) އަދި FACSDiva ސޮފްޓްވެއަރ (BD Biosciences, version 8.0.1) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ސެލް ސަސްޕެންޝަން ސޯޓްކޮށްފައިވަނީ 100 μm ނޮޒެލް ބޭނުންކޮށްގެން 20 ޕީއެސްއައިގެ ޕްރެޝަރެއްގައި ~2800 އިވެންޓްސް/ސެކަންޑްގެ ރޭޓުންނެވެ. ސަގާފީ ގޭޓިންގ ކްރައިޓީރިއާ (ސެލް ސައިޒް، ބައިމޯޑަލް ޑިސްކްރިމިނޭޝަން، އަދި ސްކެޓަރިންގ ސިފަތައް) އިން ޕީއެން އެހެން ސެލް ވައްތަރުތަކުން ރަނގަޅަށް އެކަހެރިވުން ކަށަވަރު ނުކުރެވޭތީ، ގޭޓިންގ ސްޓްރެޓެޖީ ސެޓްކޮށްފައިވަނީ މައިޓޯވައިއެފްޕީ+ އަދި ކޮންޓްރޯލް މައިޓޯވައިއެފްޕީ − މައިސްގައި ވައިއެފްޕީ އިންޓެންސިޓީއާއި އޮޓޯފްލޫރެސެންސް ސީދާ އަޅާކިޔުމަށެވެ. ވައިއެފްޕީ އެކްސައިޓް ކުރަނީ 488 ނޯޓް މީޓަރުގެ ލޭޒަރ ލައިނަކުން ސާމްޕަލް އިރެޑިއޭޓްކޮށްގެން ކަމަށާއި، ސިގްނަލް ހޯދުމަށް 530/30 ނޯޓް މީޓަރުގެ ބޭންޑް ޕާސް ފިލްޓަރެއް ބޭނުން ކުރެއެވެ. މައިޓޯވައިއެފްޕީ+ މަސްތަކުގައި ރޮޒާ26-މައިޓޯވައިއެފްޕީ ރިޕޯޓަރ ޖީންގެ ނިސްބަތުން ވަރުގަދަކަން ވެސް ނިއުރޯނަލް ހަށިގަނޑާއި އެކްސަން ފްރެގްމެންޓްތައް ވަކިކުރުމަށް ބޭނުންކުރެއެވެ. 7-އޭއޭޑީ 561 ނޯޓް މީޓަރުގެ ރީނދޫ ލޭޒަރަކުން އެކްސައިޓްކޮށް، 675/20 ނޯޓް މީޓަރުގެ ބެންޑްޕާސް ފިލްޓަރަކުން ޑިޓެކްޓްކޮށް މަރުވެފައިވާ ސެލްތައް ބާކީ ކުރެވެއެވެ. އެއްފަހަރާ އެސްޓްރޯސައިޓްތައް ވަކިކުރުމަށްޓަކައި ސެލް ސަސްޕެންޝަން އޭސީއެސްއޭ-2-އޭޕީސީ އިން ސްޓެއިންކޮށް، ދެން ސާމްޕަލް 640 ނޯޓް މީޓަރުގެ ލޭޒަރ ލައިނަކުން އިރެޑިއޭޓްކޮށް، ސިގްނަލް ހޯދުމަށް 660/20 ނޯޓް މީޓަރުގެ ބޭންޑްޕާސް ފިލްޓަރެއް ބޭނުންކުރިއެވެ.
އެއްކުރި ސެލްތައް ސެންޓްރިފިގޭޝަން (1110 rpm، 5 މިނެޓް، 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް) އިން ޕެލެޓްކޮށް ބޭނުން ކުރަންދެން -80 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ރައްކާކޮށްފައިވެއެވެ. Mfn2cKO މަސްތަކާއި އެމީހުންގެ ކުނި ކުދިން އެއްދުވަހަކު ކްލަސިފައި ކުރެވެނީ ޕްރޮސީޖަރަލް ވެރިއޭބިލިޓީ އެންމެ ކުޑަކުރުމަށެވެ. އެފްއޭސީއެސް ޑޭޓާ ޕްރެޒެންޓޭޝަން އަދި އެނަލިސިސް ހެދީ ފްލޯޖޯ ސޮފްޓްވެއާ (ފްލޯޖޯ އެލްއެލްސީ، އޭޝްލެންޑް، އޮރެގަން، ޔޫއެސްއޭ) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
މަތީގައި ބަޔާންކުރެވުނު ފަދައިން (59) ރިއަލް ޓައިމް ޕީސީއާރު ބޭނުންކޮށްގެން ސޯރޓް ކުރެވިފައިވާ ނިއުރޯންތަކުން ޑީއެންއޭ އެކަހެރިކޮށް، އޭގެ ފަހުން އެމްޓީޑީއެންއޭ ކިއުއަންޓިފިކޭޝަން ކުރެވެއެވެ. ލައިނޭރިޓީ އާއި ތްރެޝްހޯލްޑް ސެންސިޓިވިޓީ ފުރަތަމަ ޓެސްޓްކޮށްފައިވަނީ އެކި އަދަދުގެ ސެލްތަކުގައި ކިއުޕީސީއާރު ހިންގުމުންނެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ 50 އެމްއެމް ޓްރިސް-އެޗްސީއެލް (ޕީއެޗް 8.5)، 1 އެމްއެމް އީޑީޓީއޭ، 0.5% ޓްވީން 20 އަދި ޕްރޮޓީނޭޒް ކޭ (200 އެމްޖީ/އެމްއެލް) އިން އެކުލެވޭ ލައިސިސް ބަފަރެއްގައި 300 ޕީއެން އެއްކޮށް 55 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 120 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. ޕްރޮޓީނޭޒް ކޭ ފުރިހަމައަށް އިންއެކްޓިވޭޓް ވުން ޔަގީން ކުރުމަށްޓަކައި ސެލްތައް އިތުރަށް 95 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއިރު، mt-Nd1 އަށް ޚާއްޞަ ޓާކްމަން ޕްރޯބް (ތަރމޯ ފިޝަރ) ބޭނުންކޮށްގެން 7900އެޗްޓީ ރިއަލް-ޓައިމް ޕީސީއާރު ސިސްޓަމް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ގައި ސެމީ ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕީސީއާރު އިން mtDNA ވަޒަން ކުރެވުނެވެ. ސައިންސް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު AIVI3E8) އަދި 18S (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު Hs99999901_s1) ޖީންތަކެވެ.
ޕްރޮޓީއޯމް ސާމްޕަލް ތައްޔާރުކުރުން. 95 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ހޫނުކޮށް ސޮނިކޭޓްކޮށްގެން، ލައިސިސް ބަފަރ ގައި [6 އެމް ގުއަނިޑައިން ކްލޮރައިޑް، 10 އެމްއެމް ޓްރިސް(2-ކާރބޮކްސީއެތައިލް) ފޮސްފިން ހައިޑްރޯކްލޮރައިޑް، 10 އެމްއެމް ކްލޮރޯއެސިޓަމައިޑް އަދި 100 އެމްއެމް ޓްރައިސް- ލައިޒް ފްރޯޒެން ނިއުރޯން ޕެލެޓްސް އެޗްސީއެލްގައި] އެވެ. ބަޔޮރަޕްޓަރ (ޑައިޖެނޯޑް) ގައި 10 މިނެޓް (30 ސިކުންތުގެ ޕަލްސް / 30 ސިކުންތުގެ ޕޯޒް ޕީރިއަޑް) އަށް ޖައްސާށެވެ. މި ސާމްޕަލް 20 އެމްއެމް ޓްރިސް-އެޗްސީއެލް (ޕީއެޗް 8.0) ގައި 1:10 ޑައިލޫޓްކޮށް، 300 އެންޖީ ޓްރިޕްސިން ގޯލްޑް (ޕްރޮމެގާ) އާއި އެއްކޮށް، 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށްގެން ފުރިހަމަ ހަޖަމުވުން ހާސިލްކޮށްފައިވެއެވެ. ދެވަނަ ދުވަހު ސާމްޕަލް 20،000 ގްރާމްގައި 20 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. އަދި ސުޕަރނެޓެންޓް %0.1 ފޯމިކް އެސިޑުން ޑައިލޫޓްކޮށް، އަމިއްލައަށް ހަދާފައިވާ ސްޓޭޖްޓިޕްސް އިން ސޮލިއުޝަން ޑީސޯލްޓް ކުރިއެވެ. މި ސާމްޕަލް ސްޕީޑްވެކް އިންސްޓްރޫމެންޓް (އެޕެންޑޯރފް ކޮންސެންޓްރޭޓަރ ޕްލަސް 5305) ގައި 45 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ހިއްކައި، އޭގެ ފަހުން ޕެޕްޓައިޑް %0.1 ފޯމިކް އެސިޑްގައި ސަސްޕެންޑް ކުރިއެވެ. ހުރިހާ ސާމްޕަލް އެއްފަހަރާ ތައްޔާރުކޮށްފައިވަނީ އެއް ފަރާތަކުންނެވެ. އެސްޓްރޯސައިޓް ސާމްޕަލްތައް ތަޙުލީލުކުރުމަށްޓަކައި 4 μg ޑީސޯލްޓެޑް ޕެޕްޓައިޑްސް ޓެންޑަމް މާސް ޓެގް (TMT10plex، ކެޓަލަގް ނަންބަރު 90110، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވަނީ ޕެޕްޓައިޑް އާއި ޓީއެމްޓީ ރިއޭޖެންޓް ރޭޝިއޯ 1:20 އިންނެވެ. ޓީއެމްޓީ ލޭބަލިންގ އަށް 0.8 މިލިގްރާމް ޓީއެމްޓީ ރިއޭޖެންޓް 70 μl އެންހައިޑްރަސް އޭސީއެން ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް، ހިކި ޕެޕްޓައިޑް 9 μl 0.1 އެމް ޓީއީއޭބީ (ޓްރައިއެތައިލްއެމޮނިއަމް ބައިކާބޮނެޓް) އަށް ރިކޮންސްޓިޓިއުޓްކޮށް، އޭސީއެންގައި 7 μl ޓީއެމްޓީ ރިއޭޖެންޓް އެޅިއެވެ. އަދި ކޮންސެންޓްރޭޝަން ހުރީ %43.75 ގައެވެ. 60 މިނެޓް ވަންދެން ބެހެއްޓުމަށްފަހު 2 μl %5 ހައިޑްރޮކްސިލަމިން އިން ރިއެކްޝަން ނިއްވާލިއެވެ. ލޭބަލް ކުރެވިފައިވާ ޕެޕްޓައިޑްތައް އެއްކޮށް، ހިއްކައި، 200μl 0.1% ފޯމިކް އެސިޑް (FA) ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް، ދެ ބަޔަކަށް ބަހާލުމަށްފަހު، އަމިއްލައަށް ހަދާފައިވާ ސްޓޭޖްޓިޕްސް ބޭނުންކޮށްގެން ޑީސޯލްޓް ކުރިއެވެ. އަލްޓިމޭޓް 3000 އަލްޓްރާ ހައި ޕާފޯމަންސް ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޯގްރާފް (އަލްޓިމޭޓް 3000 އަލްޓްރާ ހައި ޕާފޯމަންސް ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޯގްރާފް) ބޭނުންކޮށްގެން، ދެ ބައިގެ ތެރެއިން އެއް ބައި 130Å1.7μm C18 ޕާރޓިކަލްސް (ވޯޓަރސް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު SKU: 186006935) އިން ފުރިފައިވާ 1mm x 150mm އެކިއުޓީ ކްރޮމެޓޮގްރަފިކް ކޮލަމެއްގައި ފްރެކްޝަނޭޓް ކުރިއެވެ. ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް). 30μl/min ގެ ފްލޯ ރޭޓެއްގައި ޕެޕްޓައިޑްތައް ވަކިކޮށް، %1 އިން %50 އަށް ބަފަރ ބީ އަށް 85 މިނެޓް ވަންދެން ސްޓެޕްވައިސް ގްރޭޑިއަންޓެއްގައި 96 މިނެޓް، %50 އިން %95 އަށް ބަފަރ ބީ އަށް 3 މިނެޓް، ދެން %95 ބަފަރ ބީ އަށް 8 މިނެޓް ވަކިކުރުން؛ ބަފަރ އޭ އަކީ %5 އޭސީއެން އަދި 10 އެމްއެމް އެމޯނިއަމް ބައިކާބޮނެޓް (އޭބީސީ) ކަމަށާއި، ބަފަރ ބީ އަކީ %80 އޭސީއެން އަދި 10 އެމްއެމް އޭބީސީ އެވެ. ކޮންމެ 3 މިނެޓަކުން ފްރެކްޝަންތައް އެއްކޮށް ދެ ގްރޫޕަކަށް (1 + 17، 2 + 18، ފަދަ) އެއްކޮށް ވޭކިއުމް ސެންޓްރިފިއުޖްގައި ހިއްކާށެވެ.
އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް އެނަލިސިސް. މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީއަށް ޕެޕްޓައިޑްސް (ނަންބަރު r119.aq) ވަކިކޮށްފައިވަނީ 25 ސެންޓިމީޓަރު، 75 μm އެތެރޭ ދިގުމިނުގެ ޕިކޯފްރިޓް އެނަލިޓިކަލް ކޮލަމް (އައު އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސް، ޕާޓް ނަންބަރު PF7508250) ގައި 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ މީޑިއަމް (Dr. Maisch, mat) އާއި އެކު، EASY-nLC ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ 1200 (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ޖަރުމަނުވިލާތް). ކޮލަމް ބެހެއްޓީ 50 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައެވެ. ބަފަރ އޭ އަދި ބީ އަކީ ފެނުގައި %0.1 ފޯމިކް އެސިޑް އަދި %80 އޭސީއެން ގައި %0.1 ފޯމިކް އެސިޑް އެވެ. ޕެޕްޓައިޑްތައް ވަކިކޮށްފައިވަނީ 65 މިނެޓް ވަންދެން %6 އިން %31 އަށް ބަފަރ ބީ އަށް 200 nl/min ގެ ސްޓެޕްވައިސް ގްރޭޑިއަންޓެއްގައި، އަދި %31 އިން %50 އަށް ބަފަރ ބީ އަށް 5 މިނެޓް ވަންދެންނެވެ. އެލިއުޓް ކުރެވުނު ޕެޕްޓައިޑްތައް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ އޯބިޓްރެޕް ފިއުޝަން މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އިންނެވެ. ޕެޕްޓައިޑް ޕްރިކަސަރ އެމް/ޒެޑް މީޓަރ ކުރަނީ 350 އާއި 1500 އެމް/ޒެޑް އާއި ދެމެދުގެ ރޭންޖެއްގައި 120،000 ގެ ރިޒޮލިއުޝަން އެއްގައެވެ. %27 ނޯމަލައިޒްޑް ކޮލިޝަން އެނާޖީ ބޭނުންކޮށްގެން 2 އިން 6 އަށް ޗާޖް ސްޓޭޓް ހުންނަ އެންމެ ވަރުގަދަ ޕްރިކަސަރ ހޮވަނީ ހައި އެނަރޖީ ސީ ޓްރެޕް ޑިސޮސިއޭޝަން (HCD) ކްލީވޭޖް އަށެވެ. ސައިކަލް ޓައިމް ސެޓްކޮށްފައިވަނީ 1 s އަށެވެ. ޕެޕްޓައިޑް ފްރެގްމެންޓްގެ m/z އަގު އަޔަން ޓްރެޕްގައި ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ އެންމެ ކުޑަ އޭޖީސީ ޓާގެޓް 5×104 އާއި އިންޖެކްޝަން ޖަހާ އެންމެ ގިނަ ވަގުތު 86 މިލިސެންޓް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ފްރެގްމެންޓޭޝަން އަށް ފަހު ޕްރިކަސަރ ޑައިނަމިކް އެކްސްކްލޫޝަން ލިސްޓުގައި 45 s އަށް ބެހެއްޓިއެވެ. ޓީއެމްޓީ ލޭބަލް ކުރެވިފައިވާ ޕެޕްޓައިޑްތައް 50 ސެންޓިމީޓަރު، 75 μm ގެ އެކްލޭމް ޕެޕްމެޕް ކޮލަމް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ކެޓަލަގް ނަންބަރު 164942) ގައި ވަކިކޮށް، މައިގްރޭޝަން ސްޕެކްޓްރާތައް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ ހައި ފީލްޑް އެސިމެޓްރިކް ވޭވްފޯމް އަޔަންސް (އެފްއޭއައިއެމްއެސް) އިކުއިޕްމަންޓް ޖަހާފައިވާ އޯބިޓްރެޕް ލޫމޯސް ޓްރައިބްރިޑް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އިންނެވެ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އޮޕަރޭޓް ކުރަނީ −50 އަދި −70 ވީ ގެ ދެ ކޮމްޕެންސޭޝަން ވޯލްޓޭޖްގައެވެ.ސިންކްރޮނައިޒޭޝަން ޕްރިކަސަރަށް ބަލައިގެން ހޮވާފައިވާ އެމްއެސް3 ޓީއެމްޓީ ރިޕޯޓް އަޔަން ސިގްނަލް މީޓަރ ކުރުމަށް ބޭނުންކުރެއެވެ. ޕެޕްޓައިޑް ވަކިކުރުން ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ EASY-nLC 1200 ގައި، %90 ލައިނަރ ގްރޭޑިއަންޓް އެލޫޝަން ބޭނުންކޮށްގެން، %6 އާއި %31 އާއި ދެމެދުގެ ބަފަރ ކޮންސެންޓްރޭޝަން އެއްގައި؛ ބަފަރ އޭ އަކީ %0.1 އެފްއޭ، އަދި ބަފަރ ބީ އަކީ %0.1 އެފްއޭ އަދި %80 އޭސީއެން އެވެ. އެނަލިޓިކަލް ކޮލަމް އޮޕަރޭޓް ކުރަނީ 50 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައެވެ. ފޭމްސް ކޮމްޕެންސޭޝަން ވޯލްޓޭޖަށް ބަލައިގެން އަސްލު ފައިލް ބަހާލުމަށް ފްރީސްޓައިލް (ވަރޝަން 1.6، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުން ކުރާށެވެ.
ޕްރޮޓީން ދެނެގަނެ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބެލުން. އިންޓަގްރޭޓެޑް އެންޑްރޮމެޑާ ސަރޗް އިންޖީން ބޭނުންކޮށްގެން، އަސްލު ޑޭޓާ ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ މެކްސްކުއަންޓް ވަރޝަން 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެކިއުރިއާ ވިކްޓޯރިއާ އިން ލިބުނު Cre ރިކޮމްބިނޭޒް އަދި ވައިއެފްޕީ ސިކުއެންސްގެ އިތުރުން، މައުސް ރެފަރެންސް ޕްރޮޓީއޯމް (Proteome ID UP000000589, downloaded from UniProt in May 2017) ގެ ކެނޮނިކަލް ސިކުއެންސް އަދި އައިސޯފޯމް ސިކުއެންސް ހޯދުމަށް ޕެޕްޓައިޑް ފްރެގްމެންޓް ސްޕެކްޓްރާ ހޯދާފައިވެއެވެ. މެތިއަނިން އޮކްސިޑޭޝަން އަދި ޕްރޮޓީން އެން-ޓާރމިނަލް އެސިޓައިލޭޝަން ސެޓްކޮށްފައިވަނީ ވެރިއޭބަލް މޮޑިފިކޭޝަންތަކެއްގެ ގޮތުގައެވެ؛ ސިސްޓައިން ކާބަމޮއިލް މެތައިލޭޝަން ސެޓްކޮށްފައިވަނީ ފިކްސްޑް މޮޑިފިކޭޝަންތަކެއްގެ ގޮތުގައެވެ. ހަޖަމުކުރުމުގެ ޕެރަމިޓަރުތައް ސެޓްކޮށްފައިވަނީ “ސްޕެސިފިކްޓީ” އަދި “ޓްރިޕްސިން/ޕީ” އަށެވެ. ޕްރޮޓީން ދެނެގަތުމަށް ބޭނުންކުރާ ޕެޕްޓައިޑްތަކާއި ރޭޒަރ ޕެޕްޓައިޑްތަކުގެ އެންމެ މަދު އަދަދަކީ 1 އެވެ؛ ޔުނިކް ޕެޕްޓައިޑްތަކުގެ އެންމެ ކުޑަ އަދަދަކީ 0. ޕެޕްޓައިޑް މެޕް މެޗިންގ ގެ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން ޕްރޮޓީން ދެނެގަތުމުގެ ނިސްބަތަކީ 0.01 އެވެ. “ސެކަންޑް ޕެޕްޓައިޑް” އޮޕްޝަން އެނެބަލް ކޮށްފައި ހުރެއެވެ. އެކި އަސްލު ފައިލްތަކުގެ މެދުގައި ކާމިޔާބު އައިޑެންޓިފިކޭޝަންތައް ޓްރާންސްފާ ކުރުމަށް “match between runs” އޮޕްޝަން ބޭނުން ކުރާށެވެ. ލޭބަލް ފްރީ ކުއަންޓިފިކޭޝަން (އެލްއެފްކިޔު) އަށް އެލްއެފްކިޔޫ މިނިމަމް ރޭޝިއޯ ކައުންޓް 1 ބޭނުންކުރުން (60). އެލްއެފްކިޔޫ އިންޓެންސިޓީ ކޮންމެ ޓައިމް ޕޮއިންޓެއްގައި މަދުވެގެން އެއް ޖީނޯޓައިޕް ގްރޫޕެއްގައި މަދުވެގެން ދެ ސައްހަ އަގުތަކަށް ފިލްޓަރކޮށް، ފުޅާމިނުގައި އާދައިގެ ޑިސްޓްރިބިއުޝަނަކުން އެކްސްޓްރާޕޮލޭޓް ކުރެވެއެވެ. 0.3 އަދި ތިރިއަށް 1.8. އެލްއެފްކިޔޫގެ ނަތީޖާތައް ތަޙުލީލުކުރުމަށް ޕަރސިއަސް ކޮމްޕިއުޓިންގ ޕްލެޓްފޯމް (https://maxquant.net/perseus/) އަދި އާރ (https://r-project.org/) ބޭނުންކުރުން. ޑިފެރެންޝަލް އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް އަށް ލިމާ ސޮފްޓްވެއާ ޕެކޭޖުން ލިބުނު ޓޫ-ވޭ މޮޑެރޭޓް ޓީ ޓެސްޓެއް ބޭނުންކޮށްފައިވެއެވެ ( 61 ). އެކްސްޕްލޮރޭޓަރީ ޑޭޓާ އެނަލިސިސް ހެދެނީ ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally އަދި pheatmap ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ޓީއެމްޓީ އަށް ބިނާކޮށް ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާ ތަހުލީލުކޮށްފައިވަނީ މެކްސްކުއަންޓް ވަރޝަން 1.6.10.43 ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ސެޕްޓެމްބަރު 2018 ގައި ޑައުންލޯޑް ކުރި ޔުނިޕްރޮޓްގެ ހިއުމަން ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާބޭސް އިން ރޯ ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ޑޭޓާ ހޯދުން މި ތަހުލީލުގައި ހިމެނެނީ އުފެއްދުންތެރިޔާ ފޯރުކޮށްދިން އައިސޮޓޯޕް ޕިއުރިޓީ ކަރެކްޝަން ފެކްޓަރ އެވެ. ޑިފެރެންޝަލް އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް އަށް އާރ ގައި ލިމާ ބޭނުންކުރުން. އަސްލު ޑޭޓާ، ޑޭޓާބޭސް ސަރޗް ނަތީޖާ، އަދި ޑޭޓާ އެނަލިސިސް ވޯކްފްލޯ އަދި ނަތީޖާ ހުރިހާ އެއްޗެއް ވެސް ރައްކާކުރެވެނީ ޕްރައިޑް ޕާޓްނަރ ރިޕޮޒިޓަރީ މެދުވެރިކޮށް ޕްރޮޓީއޯމްއެކްސްޗޭންޖް އެލަޔަންސްގައި ޑޭޓާ ސެޓް އައިޑެންޓިފައިޓަރ PXD019690 އާއެކުގައެވެ.
ފަންކްޝަނަލް އެނޮޓޭޝަންސް އިން ތަޙުލީލު މުއްސަނދިކޮށްދެއެވެ. 8 ހަފްތާގައި ޑޭޓާ ސެޓްގެ ފަންކްޝަނަލް އެނޮޓޭޝަން ޓާމްސްގެ މުއްސަނދިކަން ދެނެގަތުމަށް އިންޖީނިއުޓީ ޕަތްވޭ އެނަލިސިސް (QIAGEN) ޓޫލް ބޭނުންކޮށްފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 1). ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް (ޓެންޑެމް މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީ) ޑޭޓާ އެނަލިސިސްއިން ލިބުނު ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕްރޮޓީން ލިސްޓް ބޭނުންކުރަނީ ތިރީގައިވާ ފިލްޓަރ ކްރައިޓީރިއާތަކާއެކު: މަސް މަސްކަލަސް ހޮވަނީ ސްޕީޝީސް އަދި ބެކްގްރައުންޑްގެ ގޮތުގައި، އަދި ކެޓަގަރީން ފެންނަނީ ބެންޖަމިން އިން ރިޗްމަންޓް 0.05 ނުވަތަ އެއަށްވުރެ ދަށް ޕީ ވެލިއު އެޖެސްޓްކުރި ޕީ ވެލިއު މުހިންމު ކަމަށް ބެލެވެއެވެ. މި ގްރާފަށް، އެޖެސްޓް ކުރެވިފައިވާ ޕީ ވެލިއުއަށް ބިނާކޮށް ކޮންމެ ކްލަސްޓަރެއްގައި ހިމެނޭ އެންމެ މަތީ ފަސް އިތުރު ކެޓަގަރީ ދައްކާފައިވެއެވެ. މަލްޓިޕަލް ޓީ ޓެސްޓް ބޭނުންކޮށްގެން، ބެންޖަމިން، ކްރިގަރ، އަދި ޔެކުޓިއެލީ (Q = 5%) ގެ ދެ މަރުހަލާގެ ލައިނަރ ބޫސްޓް ޕްރޮގްރާމް ބޭނުންކޮށްގެން، ކޮންމެ ކެޓަގަރީއެއްގައި ފާހަގަކުރެވޭ މުހިންމު ކެންޑިޑޭޓުންގެ މައްޗަށް ޓައިމް ކޯސް ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް ހަދައި، ކޮންމެ ރޯއެއް ވަކިވަކިން ތަޙުލީލުކުރެއެވެ. އެއްގޮތަކަށް ވެސް އެސްޑީއެއް ގެންގުޅެން ނުޖެހެ އެވެ.
މި ދިރާސާގެ ނަތީޖާތައް ޝާއިޢުކުރެވިފައިވާ ޑޭޓާބޭސްތަކާ އަޅާކިޔައި، ފޮޓޯ 1 ގައިވާ ވެން ޑައިގްރާމް އުފެއްދުމަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕްރޮޓީން ލިސްޓް މައިޓޯކާރޓާ 2.0 އެނޮޓޭޝަންސް އާއި ގުޅުވައިލީމެވެ (24). ޑައިގްރާމް އުފެއްދުމަށްޓަކައި އޮންލައިން ޓޫލް ޑްރޯ ވެން ޑައިގްރާމް (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ބޭނުން ކުރާށެވެ.
ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ތަޙުލީލުކުރުމަށް ބޭނުންކުރާ ތަފާސްހިސާބު އުސޫލުތަކުގެ ތަފްސީލީ މަޢުލޫމާތު ހޯދުމަށް މެޓީރިއަލްސް އެންޑް މެތޯޑްސްގެ ގުޅޭ ބަޔަށް ރިއާޔަތް ކުރައްވާށެވެ. އެހެން ހުރިހާ ތަޖުރިބާތަކަށް ވެސް ތަފްސީލީ މައުލޫމާތު އެއާ ގުޅޭ ލެޖެންޑުން ލިބިވަޑައިގަންނަވާނެ އެވެ. އެހެން ގޮތަކަށް ކަނޑައެޅިފައި ނުވާނަމަ ހުރިހާ ޑޭޓާއެއް ހާމަކޮށްފައިވަނީ މީން ± އެސްއީއެމް ގެ ގޮތުގައި ކަމަށާއި، ހުރިހާ ތަފާސްހިސާބު ތަޙުލީލުތަކެއް ކޮށްފައިވަނީ ގްރާފްޕެޑް ޕްރިޒަމް 8.1.2 ސޮފްޓްވެއަރ ބޭނުންކޮށްގެން ކަމަށެވެ.
މި ލިޔުމަށް ބޭނުންވާ ސަޕްލިމެންޓަރީ މެޓީރިއަލްސް http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 އަށް ބައްލަވާށެވެ
މިއީ ކްރިއޭޓިވް ކޮމަންސް އެޓްރިބިއުޝަން-ނޮން-ކޮމާޝަލް ލައިސަންސްގެ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން ބެހިފައިވާ އޮޕަން އެކްސެސް އާޓިކަލެކެވެ. ރިފަރަންސް.
ނޯޓް: އަޅުގަނޑުމެން ހަމައެކަނި އެދެނީ އީމެއިލް އެޑްރެސް ފޯރުކޮށްދިނުމަކީ ޕޭޖަށް ރެކޮމެންޑް ކުރާ މީހާއަށް އެނގޭނެ ގޮތަށް، އީމެއިލް ފެންނަން ބޭނުންވާ ކަމާއި އެއީ ސްޕޭމް ނޫންކަން އެނގޭނެ ގޮތަކަށެވެ. އަޅުގަނޑުމެން އެއްވެސް އީމެއިލް އެޑްރެހެއް ކެޕްޗަރ ނުކުރާނަން.
މި ސުވާލަކީ ޒިޔާރަތްކުރާ މީހެއްތޯ ޓެސްޓްކޮށް، އޮޓޮމެޓިކުން ސްޕޭމް ހުށަހެޅުން ހުއްޓުވުމަށް ބޭނުންކުރާ ސުވާލެކެވެ.
އީ.މޮޓޯރީ، އައި.އަޓަނަސޯވް، އެސް.އެމް.ވީ ކޮޗަން، ކޭ.ފޯލްޒް-ޑޮނަހޫ، ވީ.ސަކްތިވެލޫ، ޕީ.ޖިއާވަލިސްކޯ، ނ.ޓޯނީ، ޖޭ.ޕުޔަލް، ނ.-ޖީ. ލާރސަން އެވެ
ޑިސްފެންޝަނަލް ނިއުރޯންތަކުގެ ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ތަހުލީލުތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަންއާ ދެކޮޅަށް މެޓަބޮލިކް ޕްރޮގްރާމްތައް އެކްޓިވޭޓް ވެއެވެ.
އީ.މޮޓޯރީ، އައި.އަޓަނަސޯވް، އެސް.އެމް.ވީ ކޮޗަން، ކޭ.ފޯލްޒް-ޑޮނަހޫ، ވީ.ސަކްތިވެލޫ، ޕީ.ޖިއާވަލިސްކޯ، ނ.ޓޯނީ، ޖޭ.ޕުޔަލް، ނ.-ޖީ. ލާރސަން އެވެ
ޑިސްފެންޝަނަލް ނިއުރޯންތަކުގެ ޕްރޮޓީއޮމިކްސް ތަހުލީލުތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ނިއުރޯޑިޖެނެރޭޝަންއާ ދެކޮޅަށް މެޓަބޮލިކް ޕްރޮގްރާމްތައް އެކްޓިވޭޓް ވެއެވެ.
©2020 އެމެރިކަން އެސޯސިއޭޝަން ފޯރ ދަ އެޑްވާންސްމަންޓް އޮފް ސައިންސް. ހުރިހާ ހައްޤުތަކެއް ލިބިގެންވެއެވެ. އޭއޭއޭއެސް އަކީ ހިނާރީ، އަގޯރާ، އޮއާރޭ، ކޯރަސް، ކްލޮކްސްއެސް، ކްރޮސްރެފް އަދި ކައުންޓަރުގެ ޕާޓްނަރެކެވެ. ސައިންސްއެޑްވާންސެސް އައިއެސްއެސްއެން 2375-2548.