ސެލް ކޮމްޕާރޓްމަންޓަލައިޒޭޝަން އަދި ހޯމޯސްޓޭސިސް ދެމެހެއްޓުމަށް ސެކްރެޓަރީ މަގުގައި ޕްރޮޓީން ސޯރޓިންގ އަކީ ކޮންމެހެން ބޭނުންތެރި ކަމެކެވެ. ޝެލް މެދުވެރިކޮށް ސޯރޓިންގ ގެ އިތުރުން ސެކްރެޓޯރީ ޓްރާންސްޕޯޓްގެ ޕްރޮސެސްގައި ކިނެސިން ސޯރޓިންގ ގައި ލިޕިޑްސްގެ ދައުރަކީ ގިނަ ދުވަސްތަކެއް ވަންދެން އުފެދިފައިވާ އަސާސީ ސުވާލެއް ކަމަށާއި އަދިވެސް ޖަވާބެއް ނުލިބޭ ކަމަށެވެ. މިތަނުގައި، އަޅުގަނޑުމެން 3ޑީ އެއްފަހަރާ މަލްޓިކަލަރ ހައި ރިޒޮލިއުޝަން ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ އިން ވިވޯ އިން ސާބިތުކޮށްދެނީ ވަރަށް ދިގު ސެރަމައިޑް ލިޕިޑް މޮއިޓީތަކާއެކު އަލަށް ސިންތެސައިޒް ކުރެވިފައިވާ ގްލައިކޯސިލްފޮސްފެޓިޑައިލިނޮސިޓޯލް-އިމޮބިލައިޒްޑް ޕްރޮޓީންތައް ކްލަސްޓަރކޮށް ސްޕެޝަލައިޒްޑް އެންޑޯޕްލާސްމްތަކަށް ކްލަސިފައިޑް ނެޓް އެގްޒިޓް ސައިޓް، މިއީ ޓްރާންސްމެމްބްރޭން ޕްރޮޓީންތަކުން ބޭނުންކުރާ ސައިޓާ ތަފާތު ކަމެވެ. މީގެ އިތުރުން، އަޅުގަނޑުމެން ދައްކާ ގޮތުގައި، އެންޑޯޕްލާސްމިކް ރެޓިކިއުލަމް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެރަމައިޑްގެ ޗޭން ދިގުމިނަކީ މި ސޯރޓިންގ ސެލެކްޓިވިޓީއަށް ވަރަށް މުހިންމު އެއްޗެކެވެ. އަޅުގަނޑުމެންގެ މި ދިރާސާއިން ލިޕިޑް ޗޭން ދިގުމިނަށް ބަލައިގެން ޕްރޮޓީން ކާގޯތައް ސެކްރެޓަރީ މަގުގައި ސެލެކްޓިވް އެކްސްޕޯޓް ސައިޓްތަކަށް ގިންތިކުރުމަށް ފުރަތަމަ ސީދާ އިން ވިވޯ ހެކި ލިބިގެންދެއެވެ.
ޔޫކެރިއޮޓިކް ސެލްތަކުގައި އެންޑޯޕްލާސްމިކް ރެޓިކިއުލަމް (ER) ގައި ސިންތެސިސް ކުރެވިފައިވާ ޕްރޮޓީންތައް އެއަށްފަހު ސެކްރެޓަރީ މަގު މެދުވެރިކޮށް ދަތުރުކުރުމުގެ ތެރޭގައި ސޯޓްކޮށް އެ ޕްރޮޓީންތަކަށް އެކަށީގެންވާ ސެލްއުލަރ މަންޒިލަށް ފޯރުކޮށްދެއެވެ (1). ކޯޓް މެދުވެރިކޮށް ސޯރޓިންގ ގެ އިތުރުން ވަކި ލިޕިޑްތަކަކީ ވަކި ޕްރޮޓީންތަކެއް ކަމަށްވާ ވަކި މެމްބަރޭން ޑޮމެއިންތަކަށް ކްލަސްޓަރކޮށްގެން ސެލެކްޓިވް އެގްޒިޓް ޕޮއިންޓެއްގެ ގޮތުގައި ވެސް ހިދުމަތް ކުރެވިދާނެ އެއްޗެއް ކަމަށް ގިނަ ދުވަސްތަކެއް ވަންދެން ލަފާކުރެވުނެވެ (2-5). ނަމަވެސް އަދިވެސް މި ލިޕިޑް އަށް ބިނާކޮށް އުފެދިދާނެ މެކޭނިޒަމް ސާބިތުކޮށްދޭނެ ސީދާ އިން ވިވޯ ހެކިތަކެއް ނެތެވެ. މި އަސާސީ މައްސަލަ ހައްލުކުރުމަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން ޔީސްޓްގައި ދިރާސާކުރީ، ގްލައިކޯސިލްފޮސްފެޓިޑައިލިނޮސިޓޯލް (ޖީޕީއައި) އެންކަރޑް ޕްރޮޓީންސް (ޖީޕީއައި-އޭޕީ) އީއާރް އިން ތަފާތު ގޮތަކަށް އެކްސްޕޯޓް ކުރެވޭ ގޮތެވެ. ޖީޕީއައި-އޭޕީ އަކީ ލިޕިޑް އާއި ގުޅިފައިވާ ސެލް ސަރފޭސް ޕްރޮޓީންތަކުގެ ތެރެއިން ތަފާތު ޕްރޮޓީންތަކެކެވެ ( 6, 7 ). ޖީޕީއައި-އޭޕީ އަކީ ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭންގެ ބޭރު ލީފްލެޓްތަކުގައި ގްލައިކޮލިޕިޑް މޮއިޓީ (ޖީޕީއައި އެންކަރ) މެދުވެރިކޮށް ގުޅިފައިވާ ޕްރޮޓީނެކެވެ. އެމީހުން ޖީޕީއައި އެންކަރސް ޤަބޫލުކުރަނީ އީއާރް ލޫމެންގައި ކޮންޒަރވޭޓިވް ޕޯސްޓް ޓްރާންސްލޭޝަނަލް މޮޑިފިކޭޝަންތަކެއްގެ ގޮތުގައެވެ (8). އެޓޭޗްމަންޓަށްފަހު ޖީޕީއައި-އޭޕީ ގޯލްޖީ އެޕެރެޓަސް (5، 9) މެދުވެރިކޮށް އީއާރް އިން ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން އަށް ފާއިތުވެއެވެ. ޖީޕީއައި އެންކަރސް ހުރުމުން ޖީޕީއައި-އޭޕީ ޓްރާންސްމެމްބްރޭން ސެކްރެޓެޑް ޕްރޮޓީންސް (އެހެން ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން ޕްރޮޓީންތައް ހިމެނޭގޮތަށް) އާއި ވަކިން ސެކްރެޓަރީ މަގުން ދަތުރުކުރެއެވެ (5، 9، 10). ޔީސްޓް ސެލްތަކުގައި ޖީޕީއައި-އޭޕީތައް އެންޑޯޕްލާސްމިކް ރެޓިކިއުލަމްގައި ހުންނަ އެހެން ސެކްރެޓް ޕްރޮޓީންތަކުން ވަކިކޮށް، އޭގެ ފަހުން ކޯޓް ޕްރޮޓީން ކޮމްޕްލެކްސް II (COPII) އިން އޮޅާފައިވާ ޔުނިކް ވެސިކަލްސް ތަކަށް ޕެކޭޖް ކުރެވެއެވެ (6، 7). އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ޕްރޮސެސްގައި މި ކްލަސިފިކޭޝަން ޕްރޮސެސް ކަނޑައަޅާ ކަންތައްތައް ސާފުނުވި ނަމަވެސް މި މެކޭނިޒަމަށް ލިޕިޑްސް ބޭނުންވެދާނެ ކަމަށް ލަފާކުރެވޭއިރު، ޚާއްޞަކޮށް ޖީޕީއައި އެންކަރގެ ލިޕިޑް ބައިގެ ސްޓްރަކްޗަރަލް ރިމޯޑެލިންގ ބޭނުންވެދާނެއެވެ (5، 8). ޔީސްޓްގައި ޖީޕީއައި ލިޕިޑް ރިމޯޑެލިންގ ފެށެނީ ޖީޕީއައި ގުޅިފައި ހުންނަތާ ވަގުތުން ކަމަށާއި، ގިނަ ހާލަތްތަކުގައި ސެރަމައިޑް 26 ކާބަން ލޯންގް ޗޭން ސެޗުރޭޓެޑް ފެޓީ އެސިޑް (C26:0) އާއި ގުޅެން މެދުވެރިވެއެވެ (11، 12). ސީ26 ސެރަމައިޑް އަކީ މިހާތަނަށް ޔީސްޓް ސެލްތަކުން އުފައްދާ މައިގަނޑު ސެރަމައިޑެވެ. މިއީ އީއާރް ގައި ސިންތެސައިޒް ކުރެވޭ އެއްޗެއް ކަމަށާއި އޭގެ ތެރެއިން ގިނައީ ސީއޯޕީއައިއައި ވެސިކަލްސް މެދުވެރިކޮށް ގޯލްޖީ އެޕެރެޓަސް އަށް އެކްސްޕޯޓް ކުރާ އެއްޗެއް ކަމަށް ވެސް ޑރ. ޖީޕީއައި-އޭޕީގެ އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ކުރުމަށް ޚާއްޞަކޮށް ބޭނުންވަނީ ކުރިއަށްދާ ސެރަމައިޑް ސިންތެސިސް (14، 15)، އަދި އަނެއްކާވެސް ގޯލްޖީ އެޕެރެޓަސްގައި ސެރަމައިޑް އިނޮސިޓޯލް ފޮސްފޭޓް ސެރަމައިޑް (އައިޕީސީ) އަށް ބަދަލުވުން ބިނާވެފައިވަނީ ޖީޕީއައި އެންކަރ ސިންތެސިސްގެ މައްޗަށެވެ (16). އާޓިފިޝަލް މެމްބަރޭންސް އާއި އެކު ކުރެވޭ ބަޔޯފިޒިކަލް ދިރާސާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ވަރަށް ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑްސް އެއްވެ ތަފާތު ފިޒިކަލް ޕްރޮޕަޓީތަކެއް ހުންނަ ތަރުތީބު ޑޮމެއިންތައް އުފެދިދާނެއެވެ ( 17 , 18 ). މި ޑޭޓާތަކުގެ ސަބަބުން ސީ26 ސެރަމައިޑް އަދި ސީ26 ސެރަމައިޑް އާއި އެކު ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެމީހުންގެ ފިޒިކަލް ޕްރޮޕަޓީތައް ބޭނުންކޮށްގެން ނިސްބަތުން ގޯސް އީއާރް މެމްބަރޭން ލިޕިޑް މާހައުލުގައި ތަރުތީބު ސަރަހައްދުތަކަށް ނުވަތަ ސަރަހައްދުތަކަށް އެއްވެ ކަމަށް ހީވެއެވެ. މިއީ މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ކުރު އަދި އަންސެޗުރޭޓެޑް ގްލިސެރޯލިޕިޑްސް (C16:1 އަދި C18:1) އިން އެކުލެވިގެންވާ އެއްޗެކެވެ (19، 20). މި ސަރަހައްދުތައް ޚިޔާރުކޮށްގެން ވަކި އީއާރް އެގްޒިޓް ސައިޓްތަކަށް (އީއާރުއީއެސް) ފޯކަސް ކުރެވޭއިރު، ސެރަމައިޑް އަދި ސެރަމައިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެއް ޑެޑިކޭޓެޑް ކޮޕީއައި ވެސިކަލްގައި ގޯލްޖީއަށް ކޯ ޓްރާންސްޕޯޓް ކުރެވޭނެއެވެ (5).
މި ދިރާސާގައި އަޅުގަނޑުމެން ސީދާ މި ލިޕިޑް ބެސްޓް މެކޭނިޒަމް ޓެސްޓްކޮށްފައިވަނީ ސުޕަރ ރިޒޮލިއުޝަން ކޮންފޯކަލް ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ މައިކްރޯސްކޯޕީ (SCLIM) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
އަޅުގަނޑުމެން އެންމެ ފުރަތަމަ އެސްސީއެލްއައިއެމް ޓެކްނޮލޮޖީ ބޭނުންކުރީ އެސް. އީއާރްގެ ކްލަސިފިކޭޝަން ޗެކް ކުރުމަށްޓަކައި އަޅުގަނޑުމެން ބޭނުންކުރީ އިން ވިވޯގައި އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވޭ ކާގޯ އީއާރުއީއެސް އަށް ވަންނަކަން ސީދާ ގޮތެއްގައި ސިފަކުރެވޭ ޖެނެޓިކް ސިސްޓަމެކެވެ ( 7 , 23 ). ކާގޯގެ ގޮތުގައި އަޅުގަނޑުމެން ހޮވީ ގްރީން ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން (ޖީއެފްޕީ) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ސީ26 ސެރަމައިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ ޖީޕީއައި-އޭޕީ ގޭސް1 އާއި ނިއަރ-އިންފްރާރެޑް ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން (އައިއާރުއެފްޕީ) އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ސެކްރެޓެޑް ޕްރޮޓީން Mid2 އެވެ. sec31-1 ޓެމްޕަރޭޗަރ ސެންސިޓިވް މޫޓޭންޓްގައި މި ދެ ކާގޯ އެކްސްޕްރެސް ކުރެވެނީ ގެލެކްޓޯސް އިންޑަސިބަލް ޕްރޮމޯޓަރ އާއި ކޮންސްޓިޓިއުޓިވް ERES މާކެރެއްގެ ދަށުންނެވެ. ހައްދުފަހަނަޅާފައިވާ ފިނިހޫނުމިނުގައި (37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް) ސެކް31-1 ގެ މުއުޓޭޝަންގެ ސަބަބުން ސީއޯޕީއައި ކޯޓް ކޮމްޕޮނެންޓް Sec31 ގެ ވަޒީފާއަށް އަސަރުކޮށް ސީއޯޕީއައި ޖަރާސީމު އުފެދުމާއި އީއާރު އެކްސްޕޯޓް ހުއްޓުވާތީ، އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވޭ ކާގޯ އީއާރް ގައި ޖަމާވެއެވެ (23). ދަށް ފިނިހޫނުމިނަކަށް (24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް) ފިނިކުރުމަށްފަހު sec31-1 ގެ މުއުޓެންޓް ސެލްތައް ސެކްރެޓަރީ އޭރިއާ އިން ރަނގަޅުވެ، ޖަމާވެފައިވާ އާ ސިންތެޓިކް ކާގޯ އީއާރް އިން އެކްސްޕޯޓް ކުރަން ފެށިއެވެ. ސީއެލްއައިއެމް ވިޝުއަލައިޒޭޝަން އިން ދައްކާ ގޮތުގައި އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވުނު ގިނަ Gas1-GFP އަދި Mid2-iRFP އަދިވެސް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އިންކިއުބޭޓް ކުރުމަށްފަހު sec31-1 މޫޓޭންޓް ސެލްތަކުގެ އީއާރް ގައި ޖަމާވެ، އޭގެ ފަހުން 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން ދޫކޮށްލައެވެ (ފޮޓޯ 1). މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ބެހިފައިވާތީ، އަދި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކޮންސެންޓްރޭޓްވެ އެއްވެފައި ހުންނަނީ ޑިސްކޮންޓިނިއުއަސް އީއާރް މެމްބަރޭން އޭރިއާގައި ކަމުން، އެމީހުންގެ ބެހިފައިވާ ގޮތް މުޅިން ތަފާތެވެ (ފޮޓޯ 1، އޭ އިން ސީ އަދި މޫވީ އެސް1). މީގެ އިތުރުން ފޮޓޯ 1ޑީ ގައިވާ ފަދައިން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރގައި Mid2-iRFP އެއް ނެތެވެ. މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޖީޕީއައި-އޭޕީ އާއި ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ޕްރޮޓީންތައް ތަފާތު އީއާރް މެމްބަރޭން ސަރަހައްދުތަކަށް ވަކިވެފައިވަނީ ވަރަށް ކުރީކޮޅުގައެވެ. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރަކީ އެމްޗެރީގެ ސީއޯޕީއައި ކޯޓް ޕްރޮޓީން Sec13 އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ ވަކި އީއާރުއީއެސް އަކާ ޖެހިގެން ހުންނަ ކްލަސްޓަރެކެވެ (ފޮޓޯ 1، އީ އަދި އެފް، އަދި ފިލްމު އެސް1) (23).
sec31-1 ސެލްތަކުން ގެލެކްޓޯސް އިންޑައުސްޑް ސެކްރެޝަންސް އެކްސްޕްރެސްކޮށް، ދިގު އެސިލް ޗޭން (C26) ސެރަމައިޑް GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, green) އަދި ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ޕްރޮޓީން Mid2-iRFP (TMP, blue) އަދި މި ކޮންސްޓްރަކްޓިވް ERES ލޭބަލިންގ Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ބަދަލުކޮށްފައިވެއެވެ 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި، އަދި އޭގެ 5 މިނެޓް ފަހުން އެސްސީއެލްއައިއެމް އިން ތަސްވީރުކޮށްފައިވެއެވެ. (އޭ އިން ސީ އަށް) އިން ފެންނަނީ ޕްލޭނެއްގެ ތަމްސީލު މާރޖްޑް ނުވަތަ ސިންގަލް 2ޑީ އިމޭޖެއް (އޭ)، 10 ޒޭޑް-ސެކްޝަންގެ 2ޑީ ޕްރޮޖެކްޝަން އިމޭޖެއް (ބީ) ނުވަތަ ކާގޯ އަދި އީއާރުއީއެސް މާކެރުގެ 3ޑީ ސެލް ހެމިސްފިއާ އިމޭޖެއް (ސީ) އެވެ. ސްކޭލް ބާރ 1μm (އޭ އަދި ބީ) އެވެ. ސްކޭލް ޔުނިޓަކީ 0.551μm (C) އެވެ. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ޑިސްކްރީޓް އީއާރް ރީޖަންސް ނުވަތަ ކްލަސްޓަރސް އިން ފެނިފައިވާއިރު، މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ ފެނިފައިވަނީ މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭން (ސީ) ގައި ބެހިގެންނެވެ. (ޑ) މި ގްރާފުން ފެންނަނީ ހުދު ތިރި ރޮނގު (ކަނާތް) އާއި އެއްވަރަށް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރގައިވާ Gas1-GFP އަދި Mid2-iRFP ގެ ރިލޭޓިވް ފްލޫރެސެންސް އިންޓެންސިޓީއެވެ. އޭޔޫ، އަމިއްލައަށް ޔުނިޓް. (އީ އަދި އެފް) ތަމްސީލުކުރަނީ މުދަލާއި އީއާރުއީއެސް މާކް އެއްކޮށްލާ 3ޑީ އިމޭޖް އެވެ. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރތައް ފެނިފައިވަނީ ވަކި އީއާރުއީއެސް ކައިރިންނެވެ. ސްކޭލް ޔުނިޓަކީ 0.551μm އެވެ. (ފ) ހުދުކުލައިގެ ސޮލިޑް ތިރިން ފާހަގަކުރެވެނީ އީއާރުއީއެސް އާއި ގުޅިފައިވާ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރ އެވެ. މެދު އަދި ވާތް ޕެނަލް އިން ފެންނަނީ އެއްކޮށްފައިވާ ބޮޑުކޮށްފައިވާ 3ޑީ ތަސްވީރާއި ހޮވާފައިވާ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓާގެ އެނބުރޭ ވިއުއެކެވެ.
ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރ އާއި ވަކި އީއާރުއީއެސް އާއި ދެމެދު އޮންނަ ގާތް ޖާގަވެރި ގުޅުމުން ދައްކާ ގޮތުގައި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އަށް ސެލެކްޓިވް އީއާރުއީއެސް އަށް ވަދެވޭއިރު، މިއީ އީއާރް އިން ނުކުތުމަށް މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ އިން ބޭނުންކުރާ ސެލެކްޓިވިޓީއާ ތަފާތު ކަމެކެވެ. މި ފުރުޞަތު ހައްލުކުރުމަށްޓަކައި އަޅުގަނޑުމެން އީއާރުއީއެސް ރޭޝިއޯ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ކަނޑައެޅީ އެންމެ އެއް ނުވަތަ ދެ މުދަލަށެވެ (ފޮޓޯ 2، އޭ އިން ސީ އަށް). އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި ގިނަ އީއާރުއީއެސް (70%) ގައި ހިމެނެނީ އެންމެ ވައްތަރެއްގެ މުދާއެވެ. ފޮޓޯ 2ސީގެ ތިރީގައިވާ ތަސްވީރުގައި ފެންނަނީ ހަމައެކަނި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ފޮޓޯ 1) ނުވަތަ ހަމައެކަނި މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ފޮޓޯ 2) އެކުލެވޭ އީއާރުއީއެސްގެ އާދައިގެ ދެ މިސާލެކެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް އީއާރުއީއެސްގެ ގާތްގަނޑަކަށް %20 ގައި އެއް ސަރަހައްދެއްގައި އެއްކޮށް ޖެހިފައިވާ ދެ ކާގޯ ހުރެއެވެ. ބައެއް އީއާރުއީއެސް (%10) ގައި ދެ ވައްތަރެއްގެ މުދާ ހުރި ނަމަވެސް އެއީ ސާފުކޮށް ތަފާތު ސަރަހައްދުތަކެއްގައި އެކަހެރިކޮށްފައިވާ މުދާތަކެއްކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ. އެހެންކަމުން މި ތަފާސްހިސާބު ތަޙުލީލުން ދައްކާ ގޮތުގައި އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ކުރުމަށްފަހު ޖީޕީއައި-އޭޕީ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އާއި ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ކާގޯ މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ ތަފާތު އީއާރުއީއެސް އަށް ބަހާލެވިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 2ޑީ). މި ސޯރޓިންގ އެފިޝަންސީ އަކީ ކުރީގެ ބަޔޯކެމިކަލް އެނަލިސިސް (6) އާއި މޯރފޮލޮޖިކަލް ޑިޓަރމިނޭޝަން (7) އާ ވަރަށް އެއްގޮތް އެއްޗެކެވެ. އަދި އީ.އާރު.އީ.އެސް އަށް ވަންނަ ކަރަންޓީން ކުރެވިފައިވާ މުދާގެ ސުލޫކުވެސް އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނިގެންދެއެވެ (ފޮޓޯ 2އީ އަދި ފިލްމު އެސް2). ފޮޓޯ 2އީ އިން ފެންނަ ގޮތުގައި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ޕެނަލް 3) ނުވަތަ މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ޕެނަލް 4) ގެ ކުޑަ ބައެއް އެއްފަރާތުން އީއާރުއީއެސް އަށް ވަދެ ވަކި ސަރަހައްދެއްގައި ބަންދުވެފައި ހުރެއެވެ. ފޮޓޯ 2އީ ގެ ޕެނަލް 5 އިން ފެންނަ ގޮތުގައި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އަދި މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ ބައެއް ފަހަރު އެއް އީއާރުއީއެސް އިން ފެންނަ ނަމަވެސް އެކި ފަރާތްތަކުން ވަދެ ތަފާތު ސީއޯޕީއައި ވެސިކަލްސް ތަމްސީލު ކުރެވިދާނެ ވަކި ސަރަހައްދުތަކެއްގައި ޖަމާވެފައި ހުރެއެވެ. އަދި ސީ26 ސެރަމައިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ ޖީޕީއައި-އޭޕީ ގޭސް1 ސެލެކްޓިވް އީއާރުއީއެސްގެ ގޮތުގައި ވަކިވުމާއި ކްލަސިފިކޭޝަން ފާހަގަކުރެވޭކަން އަޅުގަނޑުމެން ކަށަވަރުކުރީ ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ސެކްރެޝަން ކާގޯއެއް ކަމަށްވާ ޖީއެފްޕީ ޓެގްކޮށްފައިވާ ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން ޕްރޮޓީން Axl2 (27 ) އިން Mid2-iRFP އާއި އެއްގޮތް ސުލޫކު ދައްކާތީ އެވެ. (ތަސްވީރު އެސް1 އަދި ފިލްމު އެސް3). އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވޭ Axl2-GFP އަކީ Mid2-iRFP ފަދައިން ER މެމްބަރޭން މެދުވެރިކޮށް ބެހިފައިވާ އެއްޗެއް (ފޮޓޯ S1، A އަދި B) ކަމަށާއި، ގިނަ ERES ގައި Mid2-iRFP އާއި ކޯ-ލޮކަލައިޒް ވެފައިވާ އެއްޗެއް ކަމަށް ވެސް ޑރ. ފޮޓޯ 1 ގެ ޕެނަލް 1 އަދި 2. S1C އިން ފެންނަނީ ދެ ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ކާގޯ އެއްކޮށް ޖެހިފައިވާ އީއާރުއީއެސްގެ އާދައިގެ ދެ މިސާލެކެވެ. މި ހާލަތްތަކުގައި ދެ މުދާ ވެސް އީއާރުއީއެސް އަށް ވަންނަނީ އެއްކޮށް (ފޮޓޯ އެސް1އީ، ޕެނަލް 3 އަދި މޫވީ އެސް3) އެވެ.
ގެލެކްޓޯޒް އިންޑަސިބަލް ސެކްރެޝަންސް އެކްސްޕްރެސް ކުރާ sec31-1 ސެލްތައް، Gas1-GFP (GPI-AP, green) އަދި Mid2-iRFP (TMP, blue) އަދި ކޮންސްޓިޓިއުޓިވް ERES ލޭބަލިންގ Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37 ގައި ބަހައްޓައި ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރުމަށްފަހު، ސެކްރެޝަން ބްލޮކް ދޫކޮށްލުމަށް 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަށް ބަދަލުކޮށް، އޭގެ ފަހުން SCLIM އިން އިމޭޖް ކުރިއެވެ 20 މިނެޓެވެ. (އޭ އިން ސީ އަށް) ކާގޯގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް 2ޑީ ޕްރޮޖެކްޝަން އިމޭޖްސް (އޭ؛ ސްކޭލް ބާރ، 1μm) ނުވަތަ 3ޑީ ސެލް ހެމިސްފިއާ އިމޭޖްސް (ބީ އަދި ސީ؛ ސްކޭލް ޔުނިޓް، 0.456μm) އާއި އީއާރުއީއެސް އިން ފާހަގަކޮށްފައިވާ 10 ޒެޑް-ސެކްޝަންސް. (ބީ) ގައިވާ ތިރީ ޕެނަލް އަދި (ސީ) ގައިވާ ޕެނަލް އިން ޕްރޮސެސް ކުރެވިފައިވާ ތަސްވީރުތައް ދައްކާނީ ހަމައެކަނި އީއާރުއީއެސް (މެޖެންޓާ) [ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ގްރޭ) އަދި މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ލައިޓް ބްލޫ)] ގައި ހުންނަ މުދާ ދައްކާލުމަށްޓަކައެވެ. (ސ) ހުޅުވިފައިވާ ތިރި: އީއާރުއީއެސް އިން ގެންދަނީ އެންމެ މުދާ އެއް (1 އިން 4 އަށް) އެވެ. އަޅިކުލައިގެ ތިރި: އީއާރުއީއެސްގައި ހިމެނެނީ ވަކިކޮށްފައިވާ މުދާ (5) އެވެ. ހުދު ސޮލިޑް އެރޯ: ކޯ ލޮކޭޓެޑް ކާގޯ ހިމެނޭ އީއާރުއީއެސް. ތިރީގައި: ހޮވާފައިވާ އެއް އީއާރުއީއެސްގައި ހިމެނެނީ ހަމައެކަނި ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (1) ނުވަތަ މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (2) އެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 100 ނޯޓް މީޓަރެވެ. (ޑ) (ސީ) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފޮޓޯމައިކްރޯގްރާފްގެ މިންވަރު ކަނޑައެޅުން. ހަމައެކަނި އެއް ކާގޯ (ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ނުވަތަ މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ) ހިމެނޭ އީއާރުއީއެސްގެ އެވްރެޖް ޕަސެންޓް، ސެގްރެގޭޓެޑް ކާގޯ އަދި އޮވަރލެޕް ކާގޯ. މިނިވަން ތިން ތަޖުރިބާއެއްގައި 54 ސެލްއެއްގައި n=432 އެވެ. އެރަރ ބާރ = އެސްޑީ. ޓޫ-ޓޭލްޑް އަންޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓް. *** ޕީ = 0.0002. (ށ) (ސީ) އިން ފާހަގަކޮށްފައިވާ ކަރަންޓީންކޮށްފައިވާ ކާގޯގެ ހޮވާލެވުނު އީއާރުއީއެސްގެ 3ޑީ އިމޭޖް. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ފެހި) (3) ނުވަތަ މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ނުވަތަ ބްލޫ) (4) އެއްފަރާތުން އީއާރުއީއެސް (މެޖެންޓާ) އަށް ވަދެ، އީއާރުއީއެސްގެ ތެރޭގައި ހުންނަ ކުޑަ ސަރަހައްދަކަށް ހަނިވެފައި ހުރެއެވެ. ބައެއް ފަހަރު، ދެ ބާވަތުގެ މުދާ އެއް ފަރާތަކުން އެއް އީއާރުއީއެސް (5) އަށް ވަދެ، އީއާރުއީއެސްގެ ތެރޭގައި އެކަހެރި ސަރަހައްދެއްގައި ބަންދުކޮށްފައި ހުރެއެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 100 ނޯޓް މީޓަރެވެ.
ދެން އަޅުގަނޑުމެން ޓެސްޓްކުރީ އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ލޯންގް އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑް (C26) ގެ ސަބަބުން ގޭސް1 ގެ ވަކި ކްލަސްޓަރިންގ އާއި ސޯރޓިންގ ސެލެކްޓިވް އީއާރުއީއެސް އަށް ދުއްވާ ކަމުގެ ހައިޕޮތެސިސްއެކެވެ. މިކަމަށްޓަކައި އަޅުގަނޑުމެން ބޭނުންކުރީ މޮޑިފައިޑް ޔީސްޓް ސްޓްރޭން GhLag1، އޭގައި ދެ އެންޑޯޖެނަސް ސެރަމައިޑް ސިންތޭޒް Lag1 އަދި Lac1 ގެ ބަދަލުގައި GhLag1 (ކޮޓަންގެ Lag1 ހޯމޮލޮގް) ގެ ބަދަލުގައި ސެލް މެމްބަރޭން ސެރަމައިޑް ސްޓްރޭން ވަލު ވައްތަރަށްވުރެ ކުރު ޔީސްޓް ސްޓްރޭންއެއް އުފެދުނެވެ ( ފޮޓޯ 3އޭ ) (28). މާސް ސްޕެކްޓްރޯމެޓްރީ (އެމްއެސް) ތަޙުލީލުތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ވަލު ވައްތަރުގެ ސްޓްރޭންސްތަކުގައި ޖުމްލަ ސެރަމައިޑްގެ %95 އަކީ ވަރަށް ދިގު (C26) ޗޭން ސެރަމައިޑް ކަމުގައިވާއިރު، GhLag1 ގައި %85 ސެރަމައިޑް ވަރަށް ދިގު (C18 އަދި C16) އެވެ. ), ސެރަމައިޑްގެ އެންމެ %2 އަކީ ވަރަށް ދިގު (C26) ޗޭން ސެރަމައިޑް އެވެ. މިހާތަނަށް GhLag1 މެމްބަރޭން އިން ފެނިފައިވާ މައިގަނޑު ސެރަމައިޑްތަކަކީ C18 އަދި C16 ސެރަމައިޑްސް ނަމަވެސް، އެމްއެސް އެނަލިސިސް އިން ވެސް ކަށަވަރުވެފައިވަނީ GhLag1 ސްޓްރޭންގައި އެކްސްޕްރެސް ކުރެވޭ Gas1-GFP ގެ ޖީޕީއައި އެންކަރ ގައި ވަލު ވައްތަރުގެ ލިޕިޑްތަކާ އަޅާކިޔާއިރު C26 ސެރަމައިޑް ހިމެނޭކަމެވެ. ކޮލިޓީ އެއްގޮތް ( ފޮޓޯ 3އޭ ) (26) އެވެ. އެހެންކަމުން މީގެ މާނައަކީ ސެރަމައިޑް ރިމޯޑެލިންގ އެންޒައިމް Cwh43 އަކީ C26 ސެރަމައިޑް އަށް ވަރަށް ބޮޑަށް ޚިޔާރުކުރާ އެންޒައިމް އެއް ކަމެވެ، ފޮޓޯ 26 ގައިވާ ފަދައިން، މިއީ އިސްކަންދީގެން GhLag1 ސްޓްރޭންގައި ހުންނަ C26 ސެރަމައިޑްގެ ކުޑަ މިންވަރަކުން ޖީޕީއައި އެންކަރ ހިމަނާ އެއްޗެކެވެ. އެސް2 (29) އެވެ. އެހެންނަމަވެސް، GhLag1 ގެ ސެލް މެމްބަރޭންގައި އަސާސީ ގޮތުން ހިމެނެނީ ހަމައެކަނި C18-C16 ސެރަމައިޑް ކަމަށްވާއިރު، Gas1-GFP ގައި އަދިވެސް C26 ސެރަމައިޑް ހުރެއެވެ. މި ޙަޤީޤަތަކީ މި ސްޓްރޭން އަކީ އީއާރް ގައި ހުންނަ މެމްބަރޭން ސެރަމައިޑްގެ އެސިލް ޗޭން ދިގުމިނުގެ މައްސަލަ ވަކިން ހައްލުކުރުމަށް ރަނގަޅު ވަސީލަތަކަށް ވެގެންދެއެވެ. ކްލާސް އާއި ސޯރޓިންގ ގެ ހައިޕޮތެޓިކަލް ރޯލް. ދެން، ފުރަތަމަ ދިރާސާކުރީ ކޮންވެންޝަނަލް ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯސްކޯޕީ މެދުވެރިކޮށް sec31-1 ގެ ޓެމްޕަރޭޗަރ ސެންސިޓިވް މޫޓޭންޓް އެލިލް އެއް ބޭނުންކޮށްގެން GhLag1 ގައި ކްލަސްޓަރތަކެއްގެ ގޮތުގައި C26 Gas1-GFP ޖަމާވުމުގެ ޤާބިލުކަން، މިތަނުގައި އީއާރް މެމްބަރޭން ސެރަމައިޑްގައި ހުންނަނީ ހަމައެކަނި ދިގު (C18-C16) ޗޭން ( ފޮޓޯ 3 ). އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފާހަގަކުރެވުނު ގޮތުގައި sec31-1 ގައި ގިނަ Gas1-GFP ކްލަސްޓަރތަކެއްގެ ގޮތުގައި ކޮންސެންޓްރޭޓް ވެފައިވާއިރު، ދިގު (C18-C16) ދިގު ސެރަމައިޑް އީއާރް މެމްބަރޭން އާއި އެކު sec31-1 GhLag1 ގައި Gas1-GFP މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ކްލަސްޓަރ ނުވެ ބެހިފައިވަނީ މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައެވެ. ސީދާކޮށް ބުނާނަމަ، ސީ26 ސެރަމައިޑް އަށް ބިނާކޮށް ކްލަސްޓަރިންގ އަކީ ވަކި އީއާރުއީއެސް އާއި ވަރަށް ގާތް ގުޅުމެއް އޮންނަ އެއްޗަކަށް ވާތީ (ފޮޓޯ 1)، ދެން އަޅުގަނޑުމެން ތަހުގީގުކުރީ މި ޕްރޮސެސްގައި އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ޕްރޮޓީން މެކޭނިޒަމްގެ ވަޒީފާ ވެސް ހިމެނިދާނެތޯއެވެ. ޖީޕީއައި-އޭޕީ އިން އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ކުރުމަށް ޚާއްޞަ ސީއޯޕީއައި ސިސްޓަމެއް ބޭނުންކުރާއިރު، މިއީ ޖީޕީއައި އެންކަރގެ ގްލައިކެން ބައިގެ ސްޓްރަކްޗަރަލް ރިމޯޑެލިންގ ގެ ސަބަބުން ޓެޑް1 ގެ ސްޓްރަކްޗަރަލް ރިމޯޑެލިންގ އިން ހީވާގިކަމާއެކު ރެގިއުލޭޓް ކުރެވޭ ނިޒާމެކެވެ (30، 31). އެއަށްފަހު ރިކޮމްބިނޭންޓް ޖީޕީއައި-ގްލައިކެން ޓްރާންސްމެމްބްރޭން ކާގޯ ރިސެޕްޓަރ p24 ކޮމްޕްލެކްސް އިން ދެނެގަނެ، އެ ކޮމްޕްލެކްސް އިން އަނެއްކާވެސް ޚިޔާރުކޮށްގެން Lst1 ރިކްރޫޓް ކުރާއިރު، މިއީ މެޖޯރ ސީއޯޕީއައި ކާގޯ ބައިންޑިންގ ސަބްޔުނިޓް Sec24 ގެ ވަކި އައިސޯފޯމް އެއް ކަމަށާއި، ޖީޕީއައި-އޭޕީ ރިޗް ސީއޯޕީއައި އެއް އުފެއްދުމަށް ވެސިކަލްސް ބޭނުންވެއެވެ (31-33). އެހެންކަމުން މި އެއް ޕްރޮޓީންތައް (p24 ކޮމްޕްލެކްސް ކޮމްޕޮނެންޓް Emp24، GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 އަދި specific COPII ސަބްޔުނިޓް Lst1) ޑިލީޝަން އާއި sec31-1 މޫޓޭންޓް ސްޓްރޭން އެއްކޮށްލައިގެން ޑަބަލް މޫޓޭންޓެއް އުފައްދައި، އެކަންކަން ދިރާސާކުރީ Is it possible to form Gas1-cluster GFP (ފޮޓޯ 3) އެވެ. އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފާހަގަކުރެވުނު ގޮތުގައި sec31-1emp24Δ އަދި sec31-1ted1Δ ގައި Gas1-GFP މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ކްލަސްޓަރ ނުވެ މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ބެހިފައިވާކަން ކުރިން sec31-1 GhLag1 ގައި ފެނުނުއިރު sec31-1lst1Δ ގައި Gas1-GFP Like sec31-1 ގައި ފެނެއެވެ. މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ސީ26 ސެރަމައިޑް ހުރުމުގެ އިތުރުން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރިންގ ވެސް p24 ކޮމްޕްލެކްސް އާއި ގުޅެން ޖެހޭ ކަމަށާއި، ވަކި އެލްއެސްޓީ1 ރިކްރޫޓްމަންޓެއް ބޭނުން ނުވާ ކަމަށެވެ. ދެން، އަޅުގަނޑުމެން ދިރާސާކުރީ އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެރަމައިޑްގެ ޗޭން ދިގުމިނުން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ޕީ24 އަށް ބައިންޑްވުން ރެގިއުލޭޓް ކުރެވޭނެ ކަމެވެ. ނަމަވެސް އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި މެމްބަރޭންގައި C18-C16 ސެރަމައިޑް ހުރުމުން p24 ކޮމްޕްލެކްސް އިން ރިކޮންސްޓްރަކްޓް ކުރާ ޖީޕީއައި-ގްލައިކެންސް އަށް ނުވަތަ ޖީޕީއައި-އޭޕީ އާއި ގުޅިގެން ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެކްސްޕޯޓް ކުރާ ޖީޕީއައި-ގްލައިކެންސް އަށް އަސަރެއް ނުކުރެއެވެ. ކުޅަދާނަކަން. ރިކްރޫޓް ކޮޕީއައި ސަބްޓައިޕް Lst1 (ފޮޓޯ S4C) . އެހެންކަމުން ސީ26 ސެރަމައިޑް ޑިޕެންޑެންޓް ކްލަސްޓަރިންގ އަށް ތަފާތު އީއާރް އެކްސްޕޯޓް ޕްރޮޓީން މެކޭނިޒަމްތަކާ ޕްރޮޓީން އިންޓަރެކްޝަންސް ބޭނުން ނުވާ ނަމަވެސް ލިޕިޑް ދިގުމިނުން ދުއްވާ ބަދަލު ސޯރޓިންގ މެކޭނިޒަމަކަށް ތާއީދު ލިބެއެވެ. ދެން، އަޅުގަނޑުމެން ތަޙުލީލުކުރީ އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެރަމައިޑް އެސިލް ޗޭން ދިގުމިނަކީ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ސެލެކްޓިވް އީއާރުއީއެސްގެ ގޮތުގައި އެފެކްޓިވް ކްލަސިފިކޭޝަނަށް މުހިންމު އެއްޗެއްތޯއެވެ. ކުރު ޗޭން ސެރަމައިޑް އާއި އެކު GhLag1 ސްޓްރޭންގައިވާ Gas1 އީއާރް އިން ނުކުމެ ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން އަށް ވަންނަތީ ( ފޮޓޯ S5 ) އަޅުގަނޑުމެން ގަބޫލުކުރާ ގޮތުގައި ސޯރޓިންގ ދުއްވަނީ ސެރަމައިޑް އެސިލް ޗޭންގެ ދިގުމިނުން ކަމަށްވާނަމަ GhLag1 ސްޓްރޭންގައިވާ Gas1 ރީޑައިރެކްޓްކޮށް ކްރޮސް ކުރެވިދާނެއެވެ. ހަމަ މެމްބަރޭން އެއް ހުންނަ އީއާރުއީއެސް މުދާ.
(އ) GhLag1 ގެ ސެލް މެމްބަރޭންގައި މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ކުރު C18-C16 ސެރަމައިޑްސް ހިމެނޭއިރު، Gas1-GFP ގެ ޖީޕީއައި އެންކަރ ގައި އަދިވެސް ވައިލްޑް ޓައިޕް ސެލްތަކުގައި ހުންނަ C26 އައިޕީސީ ހުރެއެވެ. މަތީގައި: މާސް ސްޕެކްޓްރޯމެޓްރީ (MS) އިން ވައިލްޑް ޓައިޕް (Wt) އަދި GhLag1p ސްޓްރޭންސްގެ ސެލް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެރަމައިޑްގެ އެސިލް ޗޭން ދިގުމިން ތަޙުލީލުކުރުން. މި ޑޭޓާއިން ދައްކުވައިދެނީ ޖުމްލަ ސެރަމައިޑްގެ އިންސައްތައެވެ. މިނިވަން ތިން ތަޖުރިބާއެއްގެ އެވްރެޖް. އެރަރ ބާރ = އެސްޑީ. ޓޫ-ޓޭލްޑް އަންޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓް. **** ޕީ <0.0001. ތިރީ ޕެނަލް: ވައިލްޑް ޓައިޕް އަދި ޖީއެޗްލަގް1ޕީ ސްޓްރޭންސްގައި އެކްސްޕްރެސް ކުރެވޭ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ޖީޕީއައި-އައިޕީސީ) ޖީޕީއައި އެންކަރުގައި ހުންނަ އައިޕީސީގެ އެސިލް ޗޭން ދިގުމިނުގެ އެމްއެސް އެނަލިސިސް. މި ޑޭޓާއިން ދައްކުވައިދެނީ ޖުމްލަ އައިޕީސީ ސިގްނަލްގެ އިންސައްތައެވެ. އެވްރެޖްކޮށް ފަސް މިނިވަން ތަޖުރިބާއެކެވެ. އެރަރ ބާރ = އެސްޑީ. ޓޫ-ޓޭލްޑް އަންޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓް. ns، މުހިންމު ނޫން. ޕީ = 0.9134 އެވެ. (ބ) ގެލެކްޓޯސް އިންޑައުސްޑް Gas1-GFP އެކްސްޕްރެސް ކުރާ sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ އަދި sec31-1lst1Δ ސެލްތަކުގެ ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯގްރާފްތައް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށް އޭގެ ފަހުން ޕާފޯމް ރޫޓިން ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯސްކޯޕީ އަށް ފޮނުވާލިއެވެ 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އެވެ. ހުދު ތިރި: އީއާރް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރ. އޯޕަން އެރޯ: އަންކްލަސްޓަރޑް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ބެހިފައިވާއިރު، މިއިން ފެންނަނީ އީއާރް ސިފަ ނިއުކްލިއަރ ރިންގް ސްޓޭނިންގ އެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 5μm. (ސ) (ބީ) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފޮޓޯމައިކްރޯގްރާފްގެ މިންވަރު ކަނޑައެޅުން. ޕަންކްޓޭޓް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ސްޓްރަކްޗަރ ހުންނަ ސެލްތަކުގެ އެވްރެޖް އިންސައްތައެވެ. މިނިވަން ތިން ތަޖުރިބާއެއްގައި n≥300 ސެލް. އެރަރ ބާރ = އެސްޑީ. ޓޫ-ޓޭލްޑް އަންޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓް. **** ޕީ <0.0001.
މި މައްސަލަ ސީދާ ހައްލުކުރުމަށްޓަކައި، sec31-1 ޓެމްޕަރޭޗަރ ސެންސިޓިވް މޫޓޭންޓް އެލިލް އާއި އެކު GhLag1 ގައި Gas1-GFP އަދި Mid2-iRFP ގެ SCLIM ވިޝުއަލައިޒޭޝަން ކުރިއަށް ގެންދިޔައީމެވެ (ފޮޓޯ 4 އަދި މޫވީ S4). އީއާރް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ބެހެއްޓުމަށްފަހު، އޭގެ ފަހުން 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ދޫކޮށްލުމަށްފަހު، ކޮންވެންޝަނަލް މައިކްރޯސްކޯޕްތަކުން ފެންނަ ގޮތުގައި، އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވުނު ގޭސް1-ޖީއެފްޕީގެ ބޮޑު ބައެއް ކްލަސްޓަރވެ، މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ބެހިފައެއް ނުވެއެވެ (ފޮޓޯ 4، އޭ އަދި ބީ). މީގެ އިތުރުން އީއާރުއީއެސްގެ ބޮޑު އިންސައްތައެއްގައި (67%) ހިމެނެނީ އޭގައި އެއްތަނެއްގައި ހުންނަ ދެ ވައްތަރެއްގެ މުދާ (ފޮޓޯ 4ޑީ) އެވެ. ފޮޓޯ 4ސީގެ ޕެނަލް 1 އަދި 2 އިން ފެންނަނީ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އަދި މިޑް2-ޖީއެފްޕީ އެއްކޮށް ޖެހިފައިވާ އީއާރުއީއެސްގެ އާދައިގެ ދެ މިސާލެކެވެ. މީގެ އިތުރުން ދެ މުދާ ވެސް އެއް އީއާރުއީއެސް އަކަށް ރިކްރޫޓް ކުރެވުނެވެ (ފޮޓޯ 4އީ، ޕެނަލް 3 އަދި ފިލްމު އެސް4). އެހެންކަމުން އަޅުގަނޑުމެންގެ ނަތީޖާތަކުން ދައްކާގޮތުގައި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެރަމައިޑް އެސިލް ޗޭންގެ ދިގުމިނަކީ އީއާރް ޕްރޮޓީން އެގްރިގޭޝަން އަދި ކްލަސިފިކޭޝަންގެ މުހިންމު ކަމެއް.
ގެލެކްޓޯސް އިންޑައުސްޑް ސެކްރެޝަންސް، Gas1-GFP (GPI-AP, green) އަދި Mid2-iRFP (TMP, blue) އަދި ކޮންސްޓިޓިއުޓިވް ERES-labelled Sec13-mCherry (ERES, magenta) އެކްސްޕްރެސްކުރާ Sec31-1 GhLag1 ސެލްތައް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. 30 މިނެޓް ވަންދެން ކުރިއަށް ގެންގޮސް، 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަށް ތިރިކޮށް ސެކްރެޝަންތައް ދޫކޮށް، 20 މިނެޓް ފަހުން އެސްސީއެލްއައިއެމް އިން އިމޭޖް ކޮށްލާށެވެ. (އޭ އިން ސީ އަށް) ކާގޯ އަދި އީއާރުއީއެސް އިން ފާހަގަކޮށްފައިވާ 10 ޒޭޑް-ސެކްޝަންގެ ތަމްސީލު 2ޑީ ޕްރޮޖެކްޝަން އިމޭޖްސް (އޭ؛ ސްކޭލް ބާރ، 1μm) ނުވަތަ 3ޑީ ސެލް ހެމިސްފިއާ އިމޭޖްސް (ބީ އަދި ސީ؛ ސްކޭލް ޔުނިޓް، 0.45μm) އެވެ. (ބީ) ގައިވާ ތިރީ ޕެނަލް އަދި (ސީ) ގައިވާ ޕެނަލް އިން ޕްރޮސެސް ކުރެވިފައިވާ ތަސްވީރުތައް ދައްކާނީ ހަމައެކަނި އީއާރުއީއެސް (މެޖެންޓާ) [ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ގްރޭ) އަދި މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ލައިޓް ބްލޫ)] ގައި ހުންނަ މުދާ ދައްކާލުމަށްޓަކައެވެ. (ސ) ހުދުކުލައިން ފުރިފައިވާ ތިރި: އީއާރުއީއެސް، މުދާ އެއްކޮށް ޖެހިފައި ހުރުން. ހުޅުވާފައިވާ ތިރި: އީއާރުއީއެސްގައި ހިމެނެނީ އެންމެ އެއްޗެކެވެ. ތިރީ ޕެނަލް: ހޮވާފައިވާ އީއާރުއީއެސްގައި (ސީ) ގައި ފާހަގަކޮށްފައިވާ މުދާ (1 އަދި 2) އެއްކޮށް ޖެހިފައި ހުރެއެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 100 ނޯޓް މީޓަރެވެ. (ޑ) (ސީ) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފޮޓޯމައިކްރޯގްރާފްގެ މިންވަރު ކަނޑައެޅުން. sec31-1 އަދި sec31-1 GhLag1 ޔުނިޓްތަކުގައި ހިމެނެނީ އެންމެ ކާގޯއެއް (Gas1-GFP ނުވަތަ Mid2-iRFP) ކަމަށާއި، އެކަހެރި ކާގޯއާއި އޯވަލެޕް ކާގޯއަށް އީއާރުއީއެސްގެ އެވްރެޖް ޕަސެންޓް ހިމެނޭ ކަމަށެވެ. މިނިވަން ތިން ތަޖުރިބާއެއްގައި 54 ސެލް (sec31-1) ގައި n = 432 އަދި 47 ސެލް (sec31-1 GhLag1) ގައި n = 430 އެވެ. އެރަރ ބާރ = އެސްޑީ. ޓޫ-ޓޭލްޑް އަންޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓް. *** ޕީ = 0.0002 (sec31-1) އަދި ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1) އެވެ. (އީ) (ސީ) ގައި ފާހަގަކޮށްފައިވާ އޯވަލެޕް ކާގޯ (3) އާއި އެކު ހޮވާލެވުނު އީއާރުއީއެސްގެ 3ޑީ އިމޭޖް. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ (ފެހި) އަދި މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ (ނުވަތަ ބްލޫ) އެއްފަރާތުން އީއާރުއީއެސް (މެޖެންޓާ) އާއި ކައިރިވެ، އެއް އީއާރުއީއެސް ރެސްޓްރިކްޓެޑް އޭރިއާއެއްގައި މަޑުކުރެއެވެ. ސްކޭލް ބާރ، 100 ނޯޓް މީޓަރެވެ.
މި ދިރާސާއިން ލިޕިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ ޕްރޮޓީން ކާގޯތައް ސެކްރެޓަރީ މަގުގައި ސެލެކްޓިވް އެކްސްޕޯޓް ސައިޓްތަކަށް ގިންތިކުރެވޭ ކަމުގެ ސީދާ އިން ވިވޯ ހެކި ލިބި، ކްލަސިފިކޭޝަން ސެލެކްޓިވިޓީއަށް އެސިލް ޗޭން ދިގުމިނުގެ މުހިންމުކަން ހާމަވެއެވެ. އެސްސީއެލްއައިއެމް ކިޔާ ވަރުގަދަ އަދި އެންމެ ޒަމާނީ މައިކްރޯސްކޯޕީ ޓެކްނިކެއް ބޭނުންކޮށްގެން، އަޅުގަނޑުމެން ދައްކާލީ އަލަށް ސިންތެސިސް ކުރެވުނު Gas1-GFP (ވަރަށް ދިގު އެސިލް ޗޭން (C26) ސެރަމައިޑް ލިޕިޑް ބައި އެކުލެވޭ ބޮޑު ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން GPI-AP) ޔީސްޓް ) ޑިސްކްރީޓް އީއާރް ތަކުގައި ކްލަސްޓަރ ކުރެވިފައިވާ ސަރަޙައްދުތައް ވަކި އީއާރުއީއެސް އާއި ގުޅިފައިވާއިރު، ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ސެކްރެޓް ޕްރޮޓީންތައް މުޅި އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ބެހިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 1) އެވެ. މީގެ އިތުރުން މި ދެ ބާވަތުގެ މުދާ ތަފާތު އީއާރުއީއެސް އަށް ޚިޔާރުކޮށްގެން ވަދެއެވެ (ފޮޓޯ 2). މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ސެލްއުލަރ ސެރަމައިޑްގެ އެސިލް ޗޭން ދިގުމިން C26 އިން C18-C16 އަށް ދަށްވެ، ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ކްލަސްޓަރ ޑިސްކްރީޓް އީއާރް ރީޖަން އަށް ޑިސްޓްރަޕްޓްވެ، ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ރީރޫޓްކޮށް ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ޕްރޮޓީން އާއި އެކު އީއާރް ދޫކޮށް ހަމަ އީއާރުއީއެސް މެދުވެރިވެއެވެ (ފޮޓޯ 3 އަދި ފޮޓޯ 3). 4).
ޖީޕީއައި-އޭޕީ އިން އީއާރް އިން ނުކުތުމަށް ޚާއްޞަ ޕްރޮޓީން މެކޭނިޒަމެއް ބޭނުންކުރި ނަމަވެސް، އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި ސީ26 ސެރަމައިޑް ޑިޕެންޑެންޓް ސެޕަރޭޝަން ބަރޯސާވެފައިވަނީ އީއާރުއީއެސް ސްޕެޝަލައިޒޭޝަން އަށް މެދުވެރިވެދާނެ ޑިފެރެންޝަލް ޕްރޮޓީން އިންޓަރެކްޝަންތަކަށެވެ (ފޮޓޯ S4 އަދި S5). އޭގެ ބަދަލުގައި އަޅުގަނޑުމެންގެ ހޯދުންތަކުން ލިޕިޑް އަށް ބިނާކޮށް ޕްރޮޓީން ކްލަސްޓަރިންގ އާއި އޭގެ ފަހުން އެހެން ކާގޯތައް ބާކީކުރުމުން ދުއްވާ ބަދަލު ކްލަސިފިކޭޝަން މެކޭނިޒަމަކަށް ތާއީދު ލިބެއެވެ. އަޅުގަނޑުމެންގެ ތަޙުލީލުތަކުން ދައްކާގޮތުގައި ވަކި އީއާރުއީއެސްއަކާ ގުޅިފައިވާ Gas1-GFP ރީޖަން ނުވަތަ ކްލަސްޓަރގައި ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ސެކްރެޓެޑް ޕްރޮޓީން Mid2-iRFP ނެތްކަން ހާމަވެއެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް އީއާރް މެމްބަރޭންގައި ސީ18-ސީ16 ސެރަމައިޑްސް ހުރުމުން ޖީޕީއައި-އޭޕީ ސަރަހައްދު ނުވަތަ ކްލަސްޓަރ އުފެދުމަށް މެދުވެރި ނުވާތީ، ޓްރާންސްމެމްބަރޭން އިން ސެކްރެޓް ކުރާ ޕްރޮޓީންތައް އެއް އީއާރުއީއެސް އަށް ބާކީ ނު ނުވަތަ ބަދަލު ނުކުރެއެވެ (ފޮޓޯ 3 އަދި 4). . އެހެންކަމުން އަޅުގަނޑުމެން ހުށަހަޅަނީ ސީ26 ސެރަމައިޑް އިން ވަކި އީއާރުއީއެސް އާއި ގުޅިފައިވާ ޕްރޮޓީންތައް ކްލަސްޓަރ ކުރުމަށް މަގުފަހިކޮށްދީ ވަކިވުމާއި ކްލަސިފިކޭޝަން ދުއްވާ ކަމަށެވެ.
މި ސީ26 ސެރަމައިޑް ޑިޕެންޑެންޓް ކްލަސްޓަރިންގ ވަކި އީއާރް އޭރިއާއަކަށް ހާސިލް ކުރާނީ ކިހިނެއް ހެއްޔެވެ؟ މެމްބަރޭން ސެރަމައިޑް ލެޓަރަލްކޮށް ވަކިވުމުގެ ނަޒަރިއްޔާތުން ޖީޕީއައި-އޭޕީ އަދި ސީ26 ސެރަމައިޑް ކުދި އަދި ވަގުތުން ތަރުތީބުވާ ލިޕިޑްތައް އުފެދިދާނީ ކުރު އަދި އަންސެޗުރޭޓެޑް ގްލިސެރޯލިޕިޑްސް ހިމެނޭ އީއާރް މެމްބަރޭންގެ މާ ގަވާއިދާ ހިލާފު ލިޕިޑް މާހައުލުގައެވެ. ކޮލިޓީ ކްލަސްޓަރސް (17، 18). މި ކުދި ވަގުތީ ކްލަސްޓަރތައް p24 ކޮމްޕްލެކްސް އާއި ގުޅުމަށްފަހު އިތުރަށް ބޮޑެތި، ސްޓޭބަލް ކްލަސްޓަރތަކަށް ފިއުޒް ކުރެވިދާނެއެވެ ( 34 ). މިއާ އެއްގޮތަށް އަޅުގަނޑުމެން ދައްކާލީ C26 Gas1-GFP އިން p24 ކޮމްޕްލެކްސް އާއި މުޢާމަލާތުކޮށްގެން ބޮޑެތި ފެންނަ ކްލަސްޓަރތައް އުފެއްދުމަށް ބޭނުންވާކަމެވެ ( ފޮޓޯ 3 ). p24 ކޮމްޕްލެކްސް އަކީ ޔީސްޓް ( 35 ) ގައި ހުންނަ ތަފާތު ހަތަރު p24 ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ޕްރޮޓީން އިން އެކުލެވޭ ހެޓެރޯޒައިގަސް އޮލިގޯމަރ އެއް ކަމަށާއި، މިއީ މަލްޓިވެލެންޓް ބައިންޑިންގ ފޯރުކޮށްދޭ އެއްޗެއް ކަމަށާއި، މިއީ ކުދި ޖީޕީއައި-އޭޕީ ކްލަސްޓަރތައް ކްރޮސް ލިންކިންގ އަށް މަގުފަހިކޮށްދޭ ކަމެއް ކަމަށާއި، އެކަމުގެ ސަބަބުން ބޮޑު ސްޓޭބަލް ކްލަސްޓަރ އެއް އުފެދިދާނެ ކަމަށް ވެސް ޑރ. ޖީޕީއައި-އޭޕީތަކުގެ ޕްރޮޓީން އެކްޓޯޑޮމެއިންތަކުގެ މެދުގައި ހިނގާ މުޢާމަލާތަކީ ވެސް އެތަކެތި އެއްކުރުމަށް ބާރުފޯރުވާ އެއްޗަކަށް ވެދާނެ ކަމަށާއި، މިއީ މެމަލިއަން ޕޮލަރައިޒްޑް އެޕިތެލިއަލް ސެލްތަކުގައި އެމީހުންގެ ގޯލްޖީ ޓްރާންސްޕޯޓް ކުރާއިރު ދައްކާ ކަމެކެވެ ( 36 ). ނަމަވެސް އީއާރް މެމްބަރޭންގައި C18-C16 ސެރަމައިޑް ހުންނައިރު، p24 ކޮމްޕްލެކްސް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އާއި ގުޅިއްޖެނަމަ، ވަކި ބޮޑެތި ކްލަސްޓަރތައް ނުއުފެދޭނެއެވެ. މިކަމުގެ އަސްލު މެކޭނިޒަމް ބިނާވެފައިވަނީ ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑްގެ ވަކި ފިޒިކަލް އަދި ކެމިކަލް ޕްރޮޕަޓީތަކުގެ މައްޗަށެވެ. އާޓިފިޝަލް މެމްބަރޭންސްގެ ބަޔޯފިޒިކަލް ދިރާސާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ދިގު (C24) އަދި ކުރު (C18-C16) އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑްސް އިން ވެސް ފޭސް ސެޕަރޭޝަން މެދުވެރިވި ނަމަވެސް، ފިލްމު އަލުން ބައްޓަން ކުރުމަށް މަތީ ކަރވޭޗަރ އާއި ފިލްމް ބެންޑިންގ ޕްރޮމޯޓް ކުރެވޭނީ ހަމައެކަނި ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑްސް (C24) އިންނެވެ. މުއުޗުއަލް ރެފަރެންސް މެދުވެރިކޮށް (17، 37، 38). މިގޮތުން ދައްކާފައިވާ ގޮތުގައި Emp24 ގެ އިންސާނީ ހޯމޮލޮގް ކަމަށްވާ TMED2 ގެ ޓްރާންސްމެމްބްރޭން ހެލިކްސް ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ލޮބިއުލްސް ގައި ހުންނަ C18 ސެރަމައިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ ސްފިންގޯމައިލިން އާއި ޚިޔާރުކޮށް މުޢާމަލާތުކުރެއެވެ ( 39 ). މޮލިކިއުލަރ ޑައިނަމިކްސް (އެމްޑީ) ސިމިއުލޭޝަންސް ބޭނުންކޮށްގެން އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެނުނު ގޮތުގައި C18 އަދި C26 ސެރަމައިޑްސް ވެސް Emp24 ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ހެލިކްސްގެ ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ލޮބިއުލްސް ވަށައިގެން ޖަމާވެފައި ހުންނައިރު، އެއީ އެއްގޮތް އިސްކަންދޭ އެއްޗެހިތަކެކެވެ ( ފޮޓޯ S6 ). ފާހަގަކޮށްލެވޭ ކަމަކީ މިކަމުން ދޭހަވަނީ Emp24 ގެ ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ހެލިކްސް ގެ ސަބަބުން މެމްބަރޭންގައި ލިޕިޑްތައް އެސިމެޓްރިކް ޑިސްޓްރިބިއުޝަން އަށް މަގުފަހިވެދާނެ ކަމެވެ. މިއީ މެމަލިއަން ސެލްތަކުގެ މައްޗަށް ބިނާކޮށް ދާދިފަހުން ލިބުނު ނަތީޖާއެކެވެ. މިފަދަ އެމްޑީ ސިމިއުލޭޝަންތަކުން ވެސް އީތަރ ލިޕިޑްސް ހުރިކަން ފެނެއެވެ (40) . އެހެންކަމުން އަޅުގަނޑުމެން ލަފާކުރާ ގޮތުގައި އީއާރް26 ގެ ދެ ލޮބިއުލްގައި ހުންނަ ސީ26 ސެރަމައިޑް އަކީ ލޯކަލް ގޮތުން މުއްސަނދިވެފައިވާ އެއްޗެކެވެ. ލޫމިނަލް ލޮބިއުލްސްގައި ހުންނަ ޖީޕީއައި-އޭޕީ ސީދާ މަލްޓިވެލެންޓް ޕީ24 އާއި ގުޅިގެން ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ލޮބިއުލްސްގައި ޕީ24 ގެ ވަށައިގެން ސީ26 ސެރަމައިޑް ޖަމާވުމުން، އެއާއެކު ޕްރޮޓީން އެގްރިގޭޝަން ޕްރޮމޯޓްކޮށް، އިނގިލިތަކުގެ ތެރެއިން މެމްބަރޭން ކަރވޭޗަރ އުފެދި، ޖީޕީއައި-އޭޕީ އީއާރުއީއެސް އާއި ޖެހިގެން ހުންނަ ޑިސްކްރީޓް ސަރަހައްދުތަކަށް ވަކިވެ، މިއީ ވެސް ވަރަށް ބޮޑަށް ކަރުވާ ސަރަހައްދުތަކަށް ފަހިވާ ކަމެކެވެ އީއާރް މެމްބަރޭންގެ ސަރަހައްދުތައް ( 42 ). ކުރީގެ ރިޕޯޓްތަކުން ހުށަހަޅާފައިވާ މެކޭނިޒަމަށް ތާއީދުކޮށްފައިވެއެވެ (43، 44). ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭންގައި އޮލިގޯލެކްޓިންސް، ޕެތޯޖަންސް ނުވަތަ އެންޓިބޮޑީސް ސެރަމައިޑް ބެސްޓް ގްލައިކޯސްފިންގޮލިޕިޑްސް (ޖީއެސްއެލް) އަށް މަލްޓިވެލެންޓް ބައިންޑް ވުމުން ބޮޑު ޖީއެސްއެލް އެގްރިގޭޝަން އުފެދި، ފޭސް ސެޕަރޭޝަން އިތުރުވެ، މެމްބަރޭން ޑިފޯރމަޝަން އަދި އިންޓަރނަލައިޒޭޝަން މެދުވެރިވެއެވެ (44). އިވާބޫޗީ ފަދަ (43) ދިގު (C24) ނަމަވެސް ކުރު ނޫން (C16) އެސިލް ޗޭންތަކެއް ހުރުމުން ޖީއެސްއެލް ލެކްޓޯސިލްސެރަމައިޑް އާއި ގުޅިފައިވާ މަލްޓިވެލެންޓް ލިގަންޑުން ބޮޑެތި ކްލަސްޓަރތަކާއި މެމްބަރޭން އިންވެޖިނޭޝަން އުފެދި، ލީފްލެޓްތަކުގައި ސައިޓޯޕްލާސްމް ލިން މެދުވެރިކޮށް ސިގްނަލް ޓްރާންސްޑަކްޝަން ގުޅިފައި ހުންނަ އެސިލް ޗޭންތަކުން އިންޓަރޑިޖިޓޭޓް ވާކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ ނިއުޓްރޯފިލްސް އެވެ.
މެމަލިއަން ޕޮލަރައިޒްޑް އެޕިތެލިއަލް ސެލްތަކުގައި އެންޓި-ގޯލްޖީ ނެޓްވޯކް (TGN) ގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަން އެޕިކަލް ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭންގެ ފެންވަރަށް ހުރުމުން ޖީޕީއައި-އޭޕީ ވަކިވުމާއި ސޯރޓިންގ ކޮންޓްރޯލް ކުރެއެވެ ( 10 , 45 ). މި އެގްރިގޭޝަން ދުއްވަނީ ޖީޕީއައި-އޭޕީ އޮލިގޯމަރައިޒޭޝަން ( 36 ) ގެ ސަބަބުން ނަމަވެސް މިއީ ޔީސްޓްގައި އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފެންނަ ސެރަމައިޑް ޗޭން ދިގުމިނަށް ވެސް ބަރޯސާވެދާނެއެވެ. މެމަލިއަން ޖީޕީއައި-އޭޕީގައި އީތަރ ލިޕިޑް އަށް ބިނާކޮށްފައިވާ އެންކަރެއް ހުރި ނަމަވެސް، އަދި އޭގެ ކެމިކަލް ސްޓްރަކްޗަރ ވަރަށް ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑް އާއި ވަރަށް ތަފާތު ނަމަވެސް، ދާދިފަހުން ކުރެވުނު ދިރާސާއަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި މި ދެ ލިޕިޑްގައި ވެސް އީވޮލޫޝަނަރީ ގޮތުން އެއްގޮތް ފިޒިކަލް އަދި ކެމިކަލް ޕްރޮޕަޓީސް އެންޑް ފަންކްޝަން ހުރެއެވެ (40). އެހެންކަމުން މެމަލިއަން ސެލްތަކުގައި ހުންނަ އީތަރ ލިޕިޑް ބައި ޔީސްޓްގައި ހުންނަ ސީ26 ސެރަމައިޑް އާއި އެއްގޮތްވެދާނެ ކަމަށާއި، އޭގެ ދައުރަކީ ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެގްރިގޭޝަން އަދި ސޯރޓިންގ ކުރިއެރުވުމަށްޓަކައި މެމްބަރޭންގައި ހުންނަ ދިގު ޗޭން ސެރަމައިޑް އާއި ގުޅިގެން އުޅުމެވެ. މި ފުރުސަތު އަދިވެސް ސީދާ ޓެސްޓް ކުރަން ޖެހުނު ނަމަވެސް، ކުރީގެ ހޯދުންތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑް ގޯލްޖީ ހަށިގަނޑަށް ގެންދިއުމަކީ ސައިޓޯޕްލާސްމިކް ޓްރާންސްފާ ޕްރޮޓީންތަކުން ކުރާ ކަމެއް ނޫނެވެ. އެހެންކަމުން އިވޮލިއުޝަނަރީ ކޮންޒަރވޭޓިވް މެކޭނިޒަމް އިން ވަރަށް ދިގު އެސިލް ޗޭން ސެރަމައިޑް އަދި ޖީޕީއައި-އޭޕީ (13، 16، 20، 46، 47) އެއް ޓްރާންސްޕޯޓް ވެސިކަލްއެއްގައި ސެލެކްޓިވްކޮށް ކޯ ޓްރާންސްޕޯޓް ކުރެވޭހެން ހީވެއެވެ.
ޔީސްޓް އަދި މެމަލިއަން ޕޮލަރައިޒްޑް އެޕިތެލިއަލް ސެލް ސިސްޓަމްތަކުގައި ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެގްރިގޭޝަން އަދި އެހެން ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭން ޕްރޮޓީންތަކުން ވަކިވުން މިހުރިހާ ކަމެއް ވެސް ހިނގަނީ ސެލްގެ ފަށަލައަށް ދިއުމުގެ ކުރިންނެވެ. ޕަލަޑިނޯ އެޓް އަލް. (48) ހޯދި ހޯދުންތަކުން ދައްކާގޮތުގައި މެމަލިއަން ޕޮލަރައިޒްޑް އެޕިތެލިއަލް ސެލްތަކުގެ ޓީޖީއެންގައި ޖީޕީއައި-އޭޕީ ކްލަސްޓަރިންގ އަކީ ހަމައެކަނި ޖީޕީއައި-އޭޕީތައް އެޕިކަލް ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭންއަށް ސެލެކްޓިވް ކްލަސްޓަރިންގ އަށް ބޭނުންވާ ކަމެއް ނޫނެވެ. ސެލްގެ މަތީގައި. ޔީސްޓްގައި މި ދިރާސާއިން ދައްކާފައިވާ ގޮތުގައި އީއާރް ގައި ހުންނަ ސީ26 ސެރަމައިޑް ޑިޕެންޑެންޓް ޖީޕީއައި-އޭޕީ ކްލަސްޓަރ އިން ޕްލާސްމާ މެމްބަރޭންގައި ޖީޕީއައި-އޭޕީގެ ކްލަސްޓަރ އޯގަނައިޒޭޝަން އަދި ފަންކްޝަނަލް އެކްޓިވިޓީ ރެގިއުލޭޓް ކުރެވޭނެއެވެ ( 24 , 49 ). މި މޮޑެލްއާ އެއްގޮތަށް، GhLag1 ސެލްތަކަކީ ޖީޕީއައި އިންހިބިޓަރސް ނުވަތަ ސެލް ވޯލް އިންޓެގްރިޓީއަށް އަސަރުކުރާ ބޭސްތަކަށް އެލާޖިކް ސެލްތަކެއް (28) ކަމަށާއި، ޔީސްޓް ސެލްތަކުގެ ޖިންސީ ގުޅުން ހިންގުމުގައި ޕްރޮޖެކްޓް ކުރެވިފައިވާ ޓިޕް ސެރަމައިޑްގެ ފަންކްޝަނަލް Gas1-GFP ކްލަސްޓަރސް (49) ބޭނުންވާތީ ޖީ hLag1 ސެލްތަކުގެ ފިޒިއޮލޮޖިކަލް ނަތީޖާތަކެއް ކުރިމަތިވާނެ ކަމަށް ދައްކައެވެ. ޖީޕީއައި-އޭޕީ އެރަރ. ނަމަވެސް ލިޕިޑް ދިގުމިނަށް ބަލައިގެން ސޯރޓިންގ މެތެޑަކުން ސެލް ސަރފޭސްގެ ފަންކްޝަނަލް އޮގަނައިޒޭޝަން އީއާރް އިން ޕްރޮގްރާމް ކުރެވިފައިވާތޯ އިތުރަށް ޓެސްޓްކުރުމަކީ އަޅުގަނޑުމެންގެ ކުރިއަށް އޮތް ދިރާސާތަކުގެ މައުޟޫޢަކަށް ވާނެއެވެ.
މި މަސައްކަތުގައި ބޭނުންކުރި ސެކަރޮމައިސެސް ސެރެވިސިއޭ ސްޓްރޭންސްތައް ތާވަލް S1 ގައި ލިސްޓްކޮށްފައިވެއެވެ. ލައިވް ސެލް އިމޭޖިންގ އަށް ބޭނުންވާ އެސްސީއެލްއައިއެމްގެ އެމްއެމްވައި1583 އަދި އެމްއެމްވައި1635 ސްޓްރޭންސް އުފެއްދީ ޑަބްލިއު303 ގެ ބެކްގްރައުންޑްގައެވެ. ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން ޓެގް އާއި އެކު Sec13-mCherry އެކްސްޕްރެސް ކުރާ މި ސްޓްރޭންސް އުފެއްދީ ޓެމްޕްލޭޓެއްގެ ގޮތުގައި pFA6a ޕްލާސްމިޑް ބޭނުންކޮށްގެން ޕޮލިމިރޭޒް ޗޭން ރިއެކްޝަން (ޕީސީއާރު) އަށް ބިނާކޮށް މެތެޑެއް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ ( 23 ). ޖީއޭއެލް1 ޕްރޮމޯޓަރުގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުން ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން އިން ލޭބަލްކޮށްފައިވާ Mid2-iRFP އެކްސްޕްރެސްކުރާ ސްޓްރޭން އުފެއްދީ އަންނަނިވި ގޮތަށެވެ. pKTiRFP-KAN ވެކްޓަރ އިން iRFP-KanMx ސިކުއެންސް ޕީސީއާރު އެމްޕްލިފިކޭޝަން (E. O'Shea، Addgene plasmid number 64687 ގެ ހަދިޔާ؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ ރިސާޗް ރިސޯސް އައިޑެންޓިފައިޓަރ (RRID): Addgene_64687) އަދި އެންޑޯޖެނަސް Mid2 ގެ C-terminus އަށް ވައްދާފައިވެއެވެ. މިޑް2-އައިއާރުއެފްޕީ ޖީނޯމް ސިކުއެންސް އެމްޕްލިފައިކޮށް ޖީއޭއެލް1 ޕްރޮމޯޓަރަށް ކްލޯން ކުރުމަށްފަހު، އިންޓަގްރޭޝަން ޕްލާސްމިޑް pRS306 ގެ ނޮޓް އައި-ސެކް އައި ސައިޓަށް އިންޓަގްރޭޓް ކުރެވުނެވެ. ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ޕްލާސްމިޑް pRGS7 ޕީއެސްޓީ އައި އާއި ލައިނަރައިޒް ކޮށްގެން ޔޫއާރްއޭ3 ލޮކަސް އަށް އިންޓަގްރޭޓް ކުރެވުނެވެ.
ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ފިއުޝަން ޖީން އެކްސްޕްރެސް ކުރެވެނީ ސެންޓްރޯމިއާ (CEN) ޕްލާސްމިޑްގައި GAL1 ޕްރޮމޯޓަރުގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުން ކަމަށާއި، މިއީ ތިރީގައިވާ ގޮތަށް އުފައްދާފައިވާ އެއްޗެކެވެ. ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ސިކުއެންސް ޕީސީއާރު މެދުވެރިކޮށް pRS416-GAS1-GFP ޕްލާސްމިޑް (24) (އެލް. ޕޮޕޮލޯގެ ހަދިޔާ) އިން އެމްޕްލިފައިކޮށް، ސީއީއެން ޕްލާސްމިޑް pBEVY-GL LEU2 (ސީގެ ހަދިޔާ) ގެ Xma I–Xho I ސައިޓަށް ކްލޯން ކުރިއެވެ. މިލާ؛ އެޑްޖީން ޕްލާސްމިޑް ނަންބަރު 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225؛ އާރުއައިޑީ: އެޑްޖީން_51225). ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ޕްލާސްމިޑަށް ދީފައިވަނީ pRGS6 އެވެ. އަދި Axl2-GFP ފިއުޝަން ޖީން ވެސް pBEVY-GL LEU2 ވެކްޓަރގެ GAL1 ޕްރޮމޯޓަރުގެ ކޮންޓްރޯލްގެ ދަށުން އެކްސްޕްރެސް ކުރެވޭއިރު، އޭގެ ކޮންސްޓްރަކްޝަން ތިރީގައި މިވަނީއެވެ. ޕީސީއާރު މެދުވެރިކޮށް pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ޕްލާސްމިޑް (23) އިން Axl2-GFP ސިކުއެންސް އެމްޕްލިފައިކޮށް، pBEVY-GL LEU2 ވެކްޓަރގެ Bam HI-Pst I ސައިޓަށް ކްލޯން ކުރިއެވެ. ނަތީޖާއެއްގެ ގޮތުން ލިބުނު ޕްލާސްމިޑަށް ދީފައިވަނީ pRGS12 އެވެ. މި ދިރާސާގައި ބޭނުންކުރި އޮލިގޮނިއުކްލިއޯޓައިޑްތަކުގެ ސިކުނޑި ތާވަލް S2 ގައި ލިސްޓްކޮށްފައިވެއެވެ.
މި ސްޓްރޭން އަށް %0.2 އެޑެނިން އަދި %2 ގްލޫކޯޒް [YP-dextrose (YPD)]، %2 ރެފިނޯސް [YP-raffinose] ރިޗް ޔީސްޓް އެކްސްޓްރެކްޓް ޕްރޮޓީން p (YP) މީޑިއަމް (1 % ޔީސްޓް އެކްސްޓްރެކްޓް އަދި 2% ޕްރޮޓީން ept) ސަޕްލިމެންޓް ކުރިއެވެ. (YPR)] ނުވަތަ %2 ގެލެކްޓޯސް [YP-galactose (YPG)] ކާބަން ސޯސްއެއްގެ ގޮތުގައި، ނުވަތަ ސިންތެޓިކް މިނިމަލް މީޑިއަމް (0.15% ޔީސްޓް ނައިޓްރޯޖަން ބޭސް އަދި 0.5% އެމޯނިއަމް ސަލްފޭޓް) ގައި ނިއުޓްރިޝަނަށް ބޭނުންވާ އެކަށީގެންވާ އެމިނޯ އެސިޑްތަކާއި ބޭސްތައް އިތުރުކުރުމަށް , އަދި %2 ގްލޫކޯޒް (ސިންތެޓިކް ގްލޫކޯޒް މިނިމަލް މީޑިއަމް) ނުވަތަ 2% ގެލެކްޓޯޒް ހިމެނޭ (ސިންތެޓިކް ގެލެކްޓޯސް މިނިމަލް މީޑިއަމް) ކާބަން ސޯސްއެއްގެ ގޮތުގައި ބޭނުންކުރެއެވެ.
ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ އަށް، GAL1 ޕްރޮމޯޓަރުގެ ދަށުން ކޮންސްޓްރަކްޓް އެކްސްޕްރެސް ކުރާ ޓެމްޕަރޭޗަރ ސެންސިޓިވް sec31-1 މޫޓޭންޓް ސެލްތައް ވައިޕީއާރު މީޑިއަމްގައި 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން މީޑް ލޮގް ފޭސް އަށް ބޮޑުކުރިއެވެ. ވައިޕީޖީގައި 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 1 ގަޑިއިރު އިންޑަކްޝަން ކުރުމަށްފަހު، ސެލްތައް 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެސްޖީގައި 30 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ސެކްރެޝަން ބްލޮކުން ދޫކޮށްލުމަށްޓަކައި 24 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްއަށް ބަދަލުކޮށްފައިވެއެވެ. ކޮންކެނަވަލިން އޭ ބޭނުންކޮށްގެން ބިއްލޫރި ސްލައިޑެއްގައި ސެލްތައް ފިކްސްކޮށް އެސްސީއެލްއައިއެމް އިން އިމޭޖް ނެގިއެވެ. އެސްސީއެލްއައިއެމް އަކީ އޮލިމްޕަސް އައިއެކްސް-71 އިންވާޓްޑް ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯސްކޯޕާއި ޔޫޕީލަންއެސްއޭޕޯ 100×1.4 ނިއުމެރިކަލް އެޕަރޗަރ އޮއިލް ލެންސް (އޮލިމްޕަސް)، ހައި-ސްޕީޑް އަދި ހައި-ސިގްނަލް-ޓު-ނޮއިސް ރޭޝިއޯ ރޮޓޭޓިންގ ޑިސްކް ކޮންފޯކަލް ސްކޭނަރ (ޔޮކޯގާވާ އިލެކްޓްރިކް)، ކަސްޓަމް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ، އަދި ކަސްޓަމް ކޫލިންގ އެއްކޮށްގެން އުފައްދާފައިވާ އެއްޗެކެވެ ފޮޓޯނިކްސް) އިން ×266.7 ގެ ފައިނަލް މެގްނިފިކޭޝަން އާއި އެކު މެގްނިފައިންގ ލެންސް ސިސްޓަމަކާއި އިލެކްޓްރޯންތައް ގިނަކުރާ ޗާޖް ކަޕްލްޑް ޑިވައިސް ކެމެރާއެއް ފޯރުކޮށްދެވިދާނެއެވެ (ހަމަމަޓްސޫ ފޮޓޯނިކްސް) (21). އިމޭޖް އެކްވިޒިޝަން ކުރިއަށް ގެންދަނީ ކަސްޓަމް ސޮފްޓްވެއާ (ޔޮކޯގާވާ އިލެކްޓްރިކް) އިންނެވެ. 3ޑީ އިމޭޖްތަކަށް އަޅުގަނޑުމެން ކަސްޓަމް މެއިޑް ޕިޒޯއިލެކްޓްރިކް އެކްޗުއޭޓަރެއް ބޭނުންކޮށްގެން އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސް ވަރުގަދައަށް ވައިބްރޭޓްކޮށް، އޮޕްޓިކަލް ބައިތައް 100 ނޯޓް މީޓަރު ދުރުގައި ސްޓޭކެއްގައި އެއްކޮށްލީމެވެ. ޒޭޑް-ސްޓޭކް އިމޭޖް 3ޑީ ވޮކްސެލް ޑޭޓާއަށް ބަދަލުކޮށް، ރޮޓޭޓިން ޑިސްކް ކޮންފޯކަލް މައިކްރޯސްކޯޕަށް ބޭނުންކުރާ ތިއަރީ ޕޮއިންޓް ސްޕްރެޑް ފަންކްޝަން ބޭނުންކުރަނީ ވޮލޮސިޓީ ސޮފްޓްވެއާ (ޕަރކިންއެލްމަރ) އިން ޑިކޮންވޮލޫޝަން ޕްރޮސެސިންގ އަށް ކަމަށް ވެއެވެ. ކޯ ​​ލޮކޭޝަން އެނަލިސިސް އަށް އޮޓޮމެޓިކުން ތްރެޝްހޯލްޑް ކުރުމަށް ވޮލޮސިޓީ ސޮފްޓްވެއާ ބޭނުންކޮށްގެން ކާގޯ ހިމެނޭ ގޮތަށް އީއާރުއީއެސް ވަޒަން ކުރެވުނެވެ. ލައިން ސްކޭން އެނަލިސިސް ހެދީ މެޓަމޯރފް ސޮފްޓްވެއާ (މޮލިކިއުލަރ ޑިވައިސްސް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
ތަފާސްހިސާބުތަކުގެ މުހިންމުކަން ކަނޑައެޅުމަށް ގްރާފްޕެޑް ޕްރިޒަމް ސޮފްޓްވެއާ ބޭނުންކުރުން. ޓޫ-ޓޭލްޑް ސްޓޫޑެންޓްސް ޓީ ޓެސްޓާއި އާދައިގެ ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް (އެނޯވާ) ޓެސްޓަށް ބަލާއިރު، ގްރޫޕްތަކުގެ މެދުގައި ހުންނަ ތަފާތުތަކުގެ ސަބަބުން ޕީ <0.05 (*) އަށް ބޮޑު އަސަރެއް ކުރާ ކަމަށް ބެލެވެއެވެ.
Gas1-GFP ގެ ފްލޫރެސެންސް މައިކްރޯސްކޯޕީއަށް، ލޮގް ފޭސް ސެލްތައް ވައިޕީޑީގައި އެއްރޭ ވަންދެން ބޮޑުކޮށް، ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށް އެއްކޮށް، ފޮސްފޭޓް ބަފަރޑް ސެލައިން އިން ދެފަހަރު ދޮވެ، މަދުވެގެން 15 މިނެޓް އައިސްގައި އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް މައިކްރޯސްކޯޕްގެ ދަށުން ކުރިއަށް ގެންދިޔައެވެ. މި ތަކެތި ހޯދުމަށް ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ އޮބްޖެކްޓިވް ލެންސާއި އެލް5 (ޖީއެފްޕީ) ފިލްޓަރާއި ހަމާމަޓްސޫ ކެމެރާ އަދި އެޕްލިކޭޝަން ސުއިޓް އެކްސް (ލާސް އެކްސް) ސޮފްޓްވެއާ އާއި އެކު ލޭއިކާ ޑީއެމްއައި8 މައިކްރޯސްކޯޕް (އެޗްސީއެކްސް ޕީއެލް އޭޕީއޯ 1003/1.40 އޮއިލް ޕީއެޗް3 ސީއެސް) އެވެ. .
މި ސާމްޕަލްތައް 65 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން އެސްޑީއެސް ސާމްޕަލް ބަފަރ އިން ޑީނޭޗަރކޮށް، އޭގެ ފަހުން އެސްޑީއެސް-ޕޮލިއެކްރިލަމައިޑް ޖެލް އިލެކްޓްރޯފޯރެސިސް (PAGE) އިން ވަކިކޮށްފައިވެއެވެ. އިމިއުނޯބްލޮޓިންގ އެނަލިސިސް އަށް ލޭނަކަށް 10 μl ސާމްޕަލް ލޯޑް ކުރެވުނެވެ. ޕްރައިމަރީ އެންޓިބޮޑީ: ރެބިޓް ޕޮލިކްލޯނަލް އެންޓި-ގޭސް1 1:3000 ގެ ޑައިލޫޝަންގައި، ރެބިޓް ޕޮލިކްލޯނަލް އެންޓި-Emp24 1:500 ގެ ޑައިލޫޝަންގައި، އަދި ރެބިޓް ޕޮލިކްލޯނަލް އެންޓި-ޖީއެފްޕީ (އެޗް. ރިޒްމަންގެ ހަދިޔާއެއް) 1:3000 ގެ ޑައިލޫޝަންގައި ބޭނުންކުރުން. މައުސް މޮނޮކްލޯނަލް އެންޓި-ޕީޖީކޭ1 އެންޓިބޮޑީ ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ 1:5000 ގެ ޑައިލޫޝަން އެއްގައި (ޖޭ ޑެ ލާ ކްރޫޒްގެ ހަދިޔާއެއް) އެވެ. ސެކަންޑަރީ އެންޓިބޮޑީ: ހޯރސަރެޑިޝް ޕެރޮކްސިޑޭޒް (އެޗްއާރުޕީ) ކޮންޖަގޭޓެޑް ގޯޓް އެންޓި-ރެބިޓް އިމިއުނޯގްލޮބިއުލިން ޖީ (އައިޖީޖީ) 1:3000 ގެ ޑައިލޫޝަންގައި ބޭނުންކުރާ (ޕިއާރސް) އެވެ. އެޗްއާރުޕީ ކޮންޖަގޭޓެޑް ގޯޓް އެންޓި-މައުސް އައިޖީޖީ ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ 1:3000 ގެ ޑައިލޫޝަން އެއްގައި (ޕިއާރސް) އެވެ. އިމިއުން ރިސްޕޮންސް ޒޯން ބެލިފައިވަނީ ސުޕަރސިގްނަލް ވެސްޓް ޕިކޯ ރިއޭޖެންޓް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ގެ ކެމިލޫމިނެސެންސް މެތެޑުންނެވެ.
(31) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން، އެންރިޗްޑް އީއާރް ފްރެކްޝަންގެ މައްޗަށް ނެޗުރަލް އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން އެކްސްޕެރިމެންޓެއް ކުރިއަށް ގެންދިޔައެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ ޔީސްޓް ސެލްތައް 600 ނޯޓް މީޓަރު ( OD600) ގައި 100 އޮޕްޓިކަލް ޑެންސިޓީގައި ދެފަހަރު ޓީއެންއީ ބަފަރ [50 އެމްއެމް ޓްރިސް-އެޗްސީއެލް (ޕީއެޗް 7.5)، 150 އެމްއެމް ނޭސީއެލް، 5 އެމްއެމް އީޑީޓީއޭ، 1 އެމްއެމް ފެނިލްމެތައިލްސަލްފޮނައިލް ފްލޫރައިޑް އަދި ޕްރޮޓީޒް އިންހިބިޓަރ މިކްސްޗަރ) އިން ދޮވެލާށެވެ. އެއީ ބިއްލޫރި ބީޑްސް އިން ފަޅާލުމަށްފަހު، ސެލްގެ ކުނިތަކާއި ބިއްލޫރި ބީޑްސް ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށް ނަގާފައިވާ އެއްޗެކެވެ. އެއަށްފަހު ސުޕަރނެޓެންޓް 17،000 ގްރާމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. މި ޕެލެޓް ޓީއެންއީގައި އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް ޑިޖިޓަލިސް ސެޕޮނިން ފައިނަލް ކޮންސެންޓްރޭޝަން %1 އަށް އެޅިއެވެ. މި ސަސްޕެންޝަން 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެނބުރުވައިގެން 1 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓުމަށްފަހު، އިންސޮލޫބަލް ކޮމްޕޯނެންޓްތައް 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 13،000 ގްރާމްގައި 60 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިގޭޝަން ކޮށްގެން ނަގާފައިވެއެވެ. Gas1-GFP އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން އަށް ފުރަތަމަ ސާމްޕަލް ހުސް އެގަރޯސް ބީޑްސް (ChromoTek) އިން 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 1 ގަޑިއިރު ޕްރީ އިންކިއުބޭޓްކޮށް، އޭގެ ފަހުން GFP-Trap_A (ChromoTek) އާއި އެކު 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 3 ގަޑިއިރު އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޓެޑް ބީޑްސް %0.2 ޑައިގޮކްސިޖެނިން ހިމެނޭ ޓީއެންއީ އިން ފަސް ފަހަރު ދޮވެ، އެސްޑީއެސް ސާމްޕަލް ބަފަރ އިން އެލިއުޓްކޮށް، އެސްޑީއެސް-ޕީއޭޖީގައި ވަކިކޮށް، އިމިއުނޯބްލޮޓިންގ އިން ތަޙުލީލުކޮށްފައިވެއެވެ.
(31) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން ކްރޮސް ލިންކިންގ ޑިޓަރމިނޭޝަން ހެދީ އެންރިޗްޑް އީއާރް ފްރެކްޝަންގެ މައްޗަށެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، މުއްސަނދި ކުރެވިފައިވާ އީއާރް ފްރެކްޝަން 0.5 އެމްއެމް ޑައިތިއޮބިސް(ސުކްސިނިމިޑައިލް ޕްރޮޕިއޮނެޓް) (ޕިއަރސް، ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ރޮކްފޯޑް، އައިއެލް، ޔޫއެސްއޭ؛ 20 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް، 20 މިނިޓް) އާއި އެކު އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. ކްރޮސްލިންކިންގ ރިއެކްޝަން ނިއްވާލީ ގްލައިސިން (50 އެމްއެމް ފައިނަލް ކޮންސެންޓްރޭޝަން، 5 މިނެޓް، 20 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް) އެއްކޮށްގެންނެވެ.
ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން (50) ވައިލްޑް ޓައިޕް އަދި GhLag1 ސްޓްރޭންސްގައި ސެރަމައިޑްގެ އެމްއެސް އެނަލިސިސް ހެދިއެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ 30 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ވައިޕީޑީގައި ސެލްތައް އެކްސްޕޮނޭންޝަލް ފޭސް (3 އިން 4 OD600 ޔުނިޓް/އެމްއެލް) އަށް ބޮޑުކޮށް، 25×107 ސެލް ހޯދިއެވެ. އެމީހުންގެ މެޓަބޮލިޒަމް ނިއްވާލަނީ ޓްރައިކްލޮރޯއެސިޓިކް އެސިޑް އިންނެވެ. އެކްސްޓްރެކްޝަން ސޮލްވެންޓް [އީތަނަލް، ފެން، އީތަރ، ޕައިރިޑައިން އަދި 4.2 ނޯޓް އެމޯނިއަމް ހައިޑްރޮކްސައިޑް (15:15:5:1:0.018 v/v)] އަދި އިންޓަރނަލް ސްޓޭންޑަރޑް ސީ17 ސެރަމައިޑް (860517، އަވަންޓީ ޕޯލާރ ލިޕިޑް) ކޮލިޓީގެ 1.2 ނޯޓް މޮލް ބޭނުންކުރުން. މޮނޮމެތައިލަމިން ރިއޭޖެންޓް [މެތަނަލް، ފެން، އެން-ބިއުޓަނަލް އަދި މެތައިލަމިން ސޮލިއުޝަން (4:3:1:5 v/v)] ބޭނުންކޮށްގެން އެކްސްޓްރެކްޓްގެ މައިލްޑް އެލްކަލައިން ހައިޑްރޮލައިސިސް ހެދުމަށްފަހު، ފެން ސެޗުރޭޓެޑް އެން-ބިއުޓަނަލް ބޭނުންކޮށްގެން ޑީސޯލްޓް ކުރާށެވެ. އެންމެ ފަހުން އެކްސްޓްރެކްޓް ޕޮޒިޓިވް މޯޑް ސޮލްވެންޓް [ކްލޮރޯފޯމް/މެތަނަލް/ފެން (2:7:1) + 5 އެމްއެމް އެމޯނިއަމް އެސިޓެޓް] ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރަށް އިންޖެކްޓް ކުރިއެވެ. ސްފިންގޮލިޕިޑް މޮލިކިއުލްތައް ދެނެގަނެ ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބެލުމަށް މަލްޓި ރިއެކްޝަން މޮނިޓަރިން (އެމްއާރުއެމް) ކުރިއަށް ގެންދިޔަ އެވެ. ޓީއެސްކިޔު ވެންޓޭޖް ޓާޝަރީ ކުއަޑްރޫޕޯލް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ގައި ލިޕިޑް އެނަލިސިސް އަށް ރޮބޮޓިކް ނެނޯފްލޯ އަޔަން ސޯސް ނެނޯމޭޓް އެޗްޑީ (އެޑްވިއަން ބަޔޯސައިންސެސް، އިތަކާ، NY) އެއް ޖަހާފައިވެއެވެ. ކޮލިޝަން އެނާޖީ ކޮންމެ ސެރަމައިޑް ކެޓަގަރީއަކަށް އޮޕްޓިމައިޒް ކުރެވިފައިވެއެވެ. އެމްއެސް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވަނީ ޕޮޒިޓިވް މޯޑުގައެވެ. ކޮންމެ ބަޔޮލޮޖިކަލް ރިޕްލިކޭޓަކަށް ލިޕިޑް ސިގްނަލަކީ މިނިވަން ތިން މިންކުރުމުގެ މީޑިއަން އެވެ.
(31) ގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން، Gas1-GFP އެކްސްޕްރެސްކުރާ ސެލްތައް (800×107) އަށް ގުދުރަތީ އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން ދީފައިވެއެވެ. ސާފުކޮށްފައިވާ ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އެސްޑީއެސް-ޕީއޭޖީ އިން ވަކިކޮށް ޕޮލިވިނިލައިޑީން ފްލޫރައިޑް (ޕީވީޑީއެފް) މެމްބަރޭން އަކަށް ބަދަލުކުރިއެވެ. މި ޕްރޮޓީން ވިޝުއަލައިޒް ކޮށްފައިވަނީ ޕީވީޑީއެފް އަށް އެމައިޑް ބްލެކް އިން ސްޓޭންކޮށްގެންނެވެ. ޕީވީޑީއެފް އިން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ބޭންޑް ކަނޑައިގެން މެތަނަލް އިން 5 ފަހަރު އަދި ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ-އެމްއެސް (އެލްސީ-އެމްއެސް) ގްރޭޑްގެ ފެނުން އެއްފަހަރު ދޮވެފައިވެއެވެ. 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، ބަފަރ އަދި 500μl ތާޒާކޮށް ގިރާފައިވާ 1 M ސޯޑިއަމް ނައިޓްރައިޓް މިކްސްޗަރ އާއި އެކު 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 3 ގަޑިއިރު ވަންދެން މެމްބަރޭން ސްޓްރިޕް އިންކިއުބޭޓް ކުރުމުން، ލިޕިޑް ފްރެކްޝަން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އިން ދޫކޮށްލައި، ގްލޫކޯޒާމިން އާއި އިންއޮސިޓޯލް އާއި ދެމެދު ލައިޒްޑް ރިލީޒް އޮފް އިންއޮސިން ފޮސްފޭޓް ސެރަމައިޑް (51) އެވެ. އެއަށްފަހު މެމްބަރޭން ސްޓްރިޕް އެލްސީ-އެމްއެސް ގްރޭޑްގެ ފެނުން ހަތަރު ފަހަރު ދޮވެ، ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި ހިއްކައި، ތަޙުލީލު ކުރެވެންދެން -80 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ނައިޓްރޯޖަން ޖައްވެއްގައި ރައްކާކޮށްފައިވެއެވެ. ކޮންޓްރޯލްގެ ގޮތުގައި ކޮންމެ ތަޖުރިބާއަކަށް ޕީވީޑީއެފް މެމްބަރޭންގެ ހުސް ސާމްޕަލެއް ބޭނުންކުރިއެވެ. އެއަށްފަހު Gas1-GFP އިން ނެގި ލިޕިޑް އެމްއެސް އިން ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށެވެ (50). ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ، ޖީޕީއައި-ލިޕިޑް ހިމެނޭ ޕީވީޑީއެފް ސްޓްރިޕްތައް 75μl ނެގެޓިވް މޯލްޑް ސޮލްވެންޓް [ކްލޮރޯފޯމް/މެތަނަލް (1:2) + 5 އެމްއެމް އެމޯނިއަމް އެސިޓެޓް] ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް، އިލެކްޓްރޯސްޕްރޭ އަޔަނައިޒޭޝަން (އީއެސްއައި)-އެމްއާރްއެމް/އެމްއެސް އެނަލިސިސް އޮފް ސްފިންގޮލިޕިޑް ސްޕީޝީސް (ޓީއެސްކިޔު ވެންޓޭޖް) ފާސްކުރިއެވެ. މި ހާލަތުގައި އެމްއެސް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވަނީ ނެގެޓިވް އަޔަން މޯޑުގައެވެ.
ކުރިންވެސް ދެންނެވި ފަދައިން ޖީޕީއައި އެންކަރ ގެ ލިޕިޑް ބައި ވަކިކޮށްފައިވަނީ [3H]-inositol-labelled GPI-AP (16) އިންނެވެ. ސޮލްވެންޓް ސިސްޓަމް (55:45:10 ކްލޮރޯފޯމް-މެތަނަލް-0.25% ކޭސީއެލް) ބޭނުންކޮށްގެން ތުނި ފަށަލަ ކްރޮމެޓޮގްރަފީ މެދުވެރިކޮށް ލިޕިޑްތައް ވަކިކޮށް، އެފްއެލްއޭ-7000 (ފުޖީފިލްމް) ބޭނުންކޮށްގެން ވިޝުއަލައިޒް ކުރިއެވެ.
Gas1-GFP (600×107) އެކްސްޕްރެސްކުރާ ސެލްތައް ޓީއެންއީ ބަފަރ އިން ޓީއެންއީ ބަފަރ އިން ދެފަހަރު ދޮވެ، ބިއްލޫރި ބީޑްސް އިން ފަޅާލުމަށްފަހު، ސެލްގެ ކުނިތަކާއި ބިއްލޫރި ބީޑްސް ނައްތާލުމަށް ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. އެއަށްފަހު ސުޕަރނެޓެންޓް 17،000 ގްރާމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 1 ގަޑިއިރު ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. މި ޕެލެޓް ޓީއެންއީގައި ދޮވެ، %0.2 ޑިޖިޓަލިސް ސެޕޮނިން ހިމެނޭ ޓީއެންއީގައި 1 ޔޫ ޕީއައި-ޕީއެލްސީ (އިންވިޓްރޯޖެން) އާއި އެކު 37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 1 ގަޑިއިރު އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. އެންޒައިމް ޓްރީޓްމަންޓަށްފަހު 17،000 ގްރާމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 1 ގަޑިއިރު ވަންދެން ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށް މެމްބަރޭން ނަގާފައިވެއެވެ. އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޓް ކުރުމަށްޓަކައި Gas1-GFP ސުޕަރނެޓެންޓް GFP-Trap_A (ChromoTek) އާއި އެކު 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި އެއްރޭ ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. އެސްޑީއެސް-ޕީއޭޖީ އިން ވަކިކޮށްފައިވާ ޕިއުރިފައިޑް ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ އަށް ކޫމާސީ ބްރިލިއަންޓް ބްލޫ ކުލަ ޖަހާފައިވެއެވެ. އެކިއުޑަކްޓް ވަށައިގެންވާ އަޅި ކުލައިން ގޭސް1-ޖީއެފްޕީ ސްޓޭނިންގ ބޭންޑް ކަނޑާލުމަށްފަހު، އަޔޯޑޯއެސިޓަމައިޑް އިން އެލްކައިލޭޓްކޮށް ޑައިތިއޯތްރެއިޓޯލް އިން ރިޑަކްޝަން ކުރުމަށްފަހު ޓްރިޕްސިން އިން އިން-ޖެލް ޑައިޖެސްޝަން ހެދިއެވެ. ޖީޕީއައި-ގްލައިކެންސް އާއި އެކު ޓްރިޕްޓިކް ޕެޕްޓައިޑްސް އާއި ޕެޕްޓައިޑްސް ނެގުން އަދި ހިއްކާލުން. ހިކި ޕެޕްޓައިޑް 20 μl ފެނުގައި ގިރާލިއެވެ. އެލްސީ އަށް ބައެއް (8μl) އިންޖެކްޓް ކުރާށެވެ. ވަކި ގްރޭޑިއަންޓް ޝަރުތުތަކެއްގެ ދަށުން ޕެޕްޓައިޑްތައް ވަކިކުރުމަށް އޮކްޓޭޑެސިލްސިލޭން (އޯޑީއެސް) ކޮލަމް (ޑެވެލޮސިލް 300އޯޑީއެސް-އެޗްޖީ-5؛ އެތެރޭގެ ދިގުމިން 150 އެމްއެމް×1.0 އެމްއެމް؛ ނޮމޫރާ ކެމިކަލް، އައިޗީ ޕްރިފެކްޗަރ، ޖަޕާން) ބޭނުންކުރިއެވެ. މޮބައިލް ފޭސް އަކީ ސޮލްވެންޓް އޭ (%0.08 ފޯމިކް އެސިޑް) އާއި ސޮލްވެންޓް ބީ (%80 އެސިޓޮނިޓްރައިލްގައި %0.15 ފޯމިކް އެސިޑް) އެވެ. އެކްސެލާ އެޗްޕީއެލްސީ ސިސްޓަމް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް، ބޮސްޓަން، މެސެޗުސެޓްސް) ބޭނުންކޮށްގެން ސޮލްވެންޓް އޭ އިން 55 މިނެޓް ތެރޭގައި 50 μl min-1 ގެ ފްލޯ ރޭޓެއްގައި 5 މިނެޓް ވަންދެން ކޮލަމް އެލިއުޓްކޮށް، ދެން ސޮލްވެންޓް ބީގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަން %40 އަށް އިތުރުކުރިއެވެ. , އެމެރިކާ). މި އިލޫއޭޓް މެދުނުކެނޑި އީއެސްއައި އަޔަން ސޯސްއަށް ތަޢާރަފްކޮށް، ޖީޕީއައި-ގްލައިކެންސް އެކުލެވޭ ޓްރިޕްޓިކް ޕެޕްޓައިޑްސް އާއި ޕެޕްޓައިޑްސް އެލްޓީކިޔޫ އޯބިޓްރެޕް އެކްސްއެލް (ހައިބްރިޑް ލައިނަރ އަޔަން ޓްރެޕް-އޯބިޓްރެޕް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ؛ ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އިން ތަޙުލީލުކުރިއެވެ. އެމްއެސް ސެޓަޕްގައި ކެޕިލަރީ ސޯސްގެ ވޯލްޓޭޖް 4.5 ކިލޯވޮޓް އަށް ސެޓްކޮށް، ޓްރާންސްފާ ކެޕިލަރީގެ ފިނިހޫނުމިން 300 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ބެހެއްޓިއެވެ. ކެޕިލަރީ ވޯލްޓޭޖާއި ޓިއުބް ލެންސް ވޯލްޓޭޖް ސެޓްކޮށްފައިވަނީ 15 ވީ އަދި 50 ވީ އަށެވެ. އެމްއެސް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވަނީ ޕޮޒިޓިވް އަޔަން މޯޑް (ރިޒޮލިއުޝަން އޮފް 60،000؛ މާސް އެކިއުރެސީ އޮފް 10 ޕާޓްސް ޕަރ މިލިއަން) ގައި 300/m/z މާސް/ޗާޖް ރޭޝިއޯ (m/z) 3000 ގެ މާސް ރޭންޖެއްގައި ކަމަށްވާއިރު، އެމްއެސް/އެމްއެސް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވަނީ އެލްޓީކިޔޫ އޯބިޓްރެޕް އެކްސްއެލް ގައިވާ އަޔަން ޓްރެޕް މެދުވެރިކޮށެވެ (ސީއައިޑީ)].
އެމްޑީ ސިމިއުލޭޝަންތައް ހެދީ ގްރޮމެކްސް (52) ސޮފްޓްވެއާ އާއި މާޓިނީ 2 ފޯސް ފީލްޑް (53-55) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެއަށްފަހު ޗާރމްމް ޖީއައި މެމްބަރޭން ބިލްޑަރ (56، 57) ބޭނުންކޮށްގެން ޑައިއޮލިއޯއިލްފޮސްފަޓިޑައިލްކޮލިން (ޑީއޯޕީސީ) އަދި ސެރ ސީ18 ނުވަތަ ޑީއޯޕީސީ އަދި ސެރ ސީ26 ހިމެނޭ ބައިލޭޔަރ އެއް އުފެއްދިއެވެ. Cer C26 ގެ ޓޮޕޮލޮޖީ އާއި ކޯޑިނޭޓްސް ހޯދަނީ ސްފިންގޯސިން ޓޭލް އިން އިތުރު ބީޑްސް ނަގައިގެން ޑީއެކްސްސީއީ އިންނެވެ. ޑަބަލް ލޭޔަރ ބެލެންސްކޮށް ހިންގުމަށް ތިރީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ޕްރޮސެސް ބޭނުންކޮށް، ދެން ސިސްޓަމްގެ އެންމެ ފަހު ކޯޑިނޭޓްސް ބޭނުންކޮށްގެން Emp24 ހިމެނޭ ސިސްޓަމެއް ބިނާކުރުން. ޔީސްޓް Emp24 (ރެސިޑިއުސް 173 އިން 193 އަށް) ގެ ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ޑޮމެއިން α-ހެލިކްސް އެއްގެ ގޮތުގައި އުފެއްދީ ވިޝުއަލް އެމްޑީ (VMD) ޓޫލް މޮލިކިއުލަރ ސްޓްރަކްޗަރ (58) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ދެން، އެއްކޮށް ޖެހިފައިވާ ލިޕިޑްތައް ނައްތާލުމަށްފަހު، ޕްރޮޓީން ގަދަކޮށް ގްރެނިއުލޭޓްކޮށް، ޗާރމް ޖީއައި ބޭނުންކޮށްގެން ބައިލޭޔަރ އަށް ވައްދާފައިވެއެވެ. ފައިނަލް ސިސްޓަމްގައި ހިމެނެނީ 1202 ޑީއޯޕީސީ އަދި 302 ސެރ ސީ26 ނުވަތަ 1197 ޑީއޯޕީސީ އަދި 295 ސެރ ސީ18 އަދި އެމްޕީ24 އެވެ. މި ސިސްޓަމް 0.150M ގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަނަކަށް އަޔަނައިޒް ކުރުން. ދެ ބައިލޭޔަރ ކޮމްޕޮޒިޝަނަކަށް މިނިވަން ހަތަރު ރިޕްލިކޭޓް ހެދިއެވެ.
ލިޕިޑް ބައިލޭޔަރ ބެލެންސް ކުރަނީ ޗާރމް ޖީއައި ޕްރޮސެސް ބޭނުންކޮށްގެން ކަމަށާއި، މިއީ 405،000 ސްޓެޕް އެންމެ ކުޑަކޮށް ބެލެންސްކޮށް، ޕޮޒިޝަން ކޮންސްޓްރެއިންޓްސް މަޑުމަޑުން މަދުކޮށް ނައްތާލައި، ޓައިމް ސްޓެޕް 0.005 ޕީއެސް އިން 0.02 ޕީއެސް އަށް އިތުރުކޮށްގެންނެވެ. އިކުއިލިބްރޭޝަނަށްފަހު 0.02 ޕީއެސް ގެ ޓައިމް ސްޓެޕް އާއި އެކު 6 μs އުފައްދައެވެ. Emp24 އިންސަރޓް ކުރުމަށްފަހު، ސިސްޓަމް މިނިމައިޒްކޮށް ބެލެންސް ކުރުމަށް ހަމަ CHARMM GUI ޕްރޮސެސް ބޭނުންކޮށް، ދެން ޕްރޮޑަކްޝަންގައި 8 s އަށް ދުއްވާށެވެ.
ހުރިހާ ނިޒާމުތަކަށް ބެލެންސިންގ ޕްރޮސެސްގެ ތެރޭގައި ޕްރެޝަރު ކޮންޓްރޯލް ކުރަނީ ބެރެންޑްސަން ބެރޮސްޓޭޓް (59) އިން ކަމަށާއި، އުފެއްދުމުގެ ޕްރޮސެސްގެ ތެރޭގައި ޕްރެޝަރު ކޮންޓްރޯލް ކުރަނީ ޕަރިނެލޯ-ރަޙްމާން ބެރޮސްޓޭޓް (60) އިންނެވެ. ހުރިހާ ހާލަތެއްގައިވެސް އެވްރެޖް ޕްރެޝަރަކީ 1 ބާރ ކަމަށާއި ސެމީ އައިސޮޓްރޮޕިކް ޕްރެޝަރ ކަޕްލިންގ ސްކީމެއް ބޭނުންކުރެއެވެ. ބެލެންސް އަދި ޕްރޮޑަކްޝަން ޕްރޮސެސްގައި ސްޕީޑް ރީކެލިބްރޭޝަން އާއި އެކު ތަމަސްޓޭޓް (61) ބޭނުންކޮށްގެން ޕްރޮޓީން، ލިޕިޑް އަދި ސޮލްވެންޓް ޕާރޓިކަލްސްގެ ޓެމްޕަރޭޗަރ ކަޕްލް ކުރެވެއެވެ. މުޅި އޮޕަރޭޝަންގެ ތެރޭގައި ޓާގެޓް ޓެމްޕަރޭޗަރަކީ 310ކޭ އެވެ. ނޮން ބޮންޑިންގ އިންޓަރެކްޝަން ހޯދަނީ 0.005 ބަފަރ ޓޮލަރެންސް އާއި އެކު ވަރލެޓް ސްކީމް ބޭނުންކޮށްގެން ޕެއަރިންގ ލިސްޓެއް އުފައްދައިގެންނެވެ. ކޫލަމްބް ޓާމް ހޯދަނީ ރިއެކްޝަން ފީލްޑާއި 1.1 ނޯޓް މީޓަރުގެ ކަޓްއޮފް ޑިސްޓެންސް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. ވެންޑަރ ވާލްސް ޓާމްގައި ބޭނުންކުރަނީ 1.1 ނޯޓް މީޓަރުގެ ކަޓްއޮފް ސްކީމެއް ކަމަށާއި، ވަރލެޓް ކަޓްއޮފް ސްކީމް ބޭނުންކުރަނީ ޕޮޓެންޝަލް ޑްރިފްޓް އަށް ކަމަށް ވެސް ވިދާޅުވިއެވެ (62).
ވީއެމްޑީ ބޭނުންކޮށްގެން ޑީއޯޕީސީ ފޮސްފޭޓް ބީޑްސް ނުވަތަ ސެރަމައިޑް އޭއެމް1 ބީޑްސް އާއި ޕްރޮޓީން އާއި ދެމެދު ކަޓޯފް ރާޅު ދިގުމިނަކީ 0.7 ނޯޓް މީޓަރު ކަމަށާއި، ޕްރޮޓީން އާއި މުއާމަލާތްކުރާ ލިޕިޑްތަކުގެ އަދަދު ހޯދާ ކަމަށެވެ. ތިރީގައިވާ ފޯމިއުލާއަށް ބަލާއިރު (63) ގައިވާ ގޮތަށް ޑިޕްލީޝަން-އެންރިޗްމަންޓް (ޑީއީ) ފެކްޓަރ ހޯދާށެވެ: ޑީއީ ފެކްޓަރ = (ޕްރޮޓީންގައި ހުންނަ ޖުމްލަ ލިޕިޑްސްގެ މިންވަރު 0.7) ޕްރޮޓީން 0.7 (ޖުމްލަ ލިޕިޑްތަކުގައިވާ Cer ގެ މިންވަރު) .
ރިޕޯޓްކޮށްފައިވާ އަގު އެވްރެޖްކޮށް ލިބޭއިރު، އެރަރ ބާރތަކަކީ އެސްއީގެ މިނިވަން ހަތަރު ކޮޕީއެވެ. ޑީއީ ފެކްޓަރގެ ތަފާސްހިސާބު މުހިންމުކަން ހޯދަނީ ޓީ ޓެސްޓް [(އެވްރެޖްޑީއީ-ފެކްޓަރ-1)/އެސްއީ] އިންނެވެ. އެއް ދޫނީގެ ޑިސްޓްރިބިއުޝަނުން ޕީ ވެލިއު ހިސާބުކުރުން.
ގްރޮމެކްސް ޓޫލް ބޭނުންކޮށްގެން ޓްރޭސްގެ އެންމެ ފަހު 250 ns ގެ ތެރޭގައި Emp24 ހިމެނޭ ސިސްޓަމްގެ 2ޑީ ލެޓަރަލް ޑެންސިޓީ މެޕް ހޯދިއެވެ. ސެރަމައިޑްގެ އެންރިޗްމަންޓް/ޑިޕްލީޝަން މެޕް ހޯދުމަށްޓަކައި، ސެރ ގެ ޑެންސިޓީ މެޕް ސެރ އާއި ޑީއޯޕީސީގެ މެޕްގެ ޖުމްލައިން ބަހާލުމަށްފަހު، ހަށިގަނޑުގައި ސެރ ގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަނުން ބަހާލައެވެ. ހަމަ ކުލަ މެޕް ސްކޭލް ބޭނުން ކުރެއެވެ.
މި ލިޔުމަށް ބޭނުންވާ ސަޕްލިމެންޓަރީ މެޓީރިއަލްސް އަށް http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ބައްލަވާށެވެ
މިއީ ކްރިއޭޓިވް ކޮމަންސް އެޓްރިބިއުޝަން-ނޮން-ކޮމާޝަލް ލައިސަންސްގެ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން ބެހިފައިވާ އޮޕަން އެކްސެސް އާޓިކަލެކެވެ. ރިފަރަންސް.
ނޯޓް: އަޅުގަނޑުމެން ހަމައެކަނި އެދެނީ އީމެއިލް އެޑްރެސް ފޯރުކޮށްދިނުމަކީ ޕޭޖަށް ރެކޮމެންޑް ކުރާ މީހާއަށް އެނގޭނެ ގޮތަށް، އީމެއިލް ފެންނަން ބޭނުންވާ ކަމާއި އެއީ ސްޕޭމް ނޫންކަން އެނގޭނެ ގޮތަކަށެވެ. އަޅުގަނޑުމެން އެއްވެސް އީމެއިލް އެޑްރެހެއް ކެޕްޗަރ ނުކުރާނަން.
މި ސުވާލަކީ ޒިޔާރަތްކުރާ މީހެއްތޯ ޓެސްޓްކޮށް، އޮޓޮމެޓިކުން ސްޕޭމް ހުށަހެޅުން ހުއްޓުވުމަށް ބޭނުންކުރާ ސުވާލެކެވެ.
ސޯފިއާ ރޮޑްރިގޭޒް-ގަލާޑޯ، ކާޒޫއޯ ކުރޯކާވާ، ސުސާނާ ސާބިޑޯ-ބޮޒޯ، އަލެޖެންޑްރޯ ކޯޓެޒް · ގޯމޭޒް (އެލެޖެންޑްރޯ ކޯޓެސް-ގޮމޭޒް)، އަޓްސުކޯ އިކެޑާ (އަޓްސުކޯ އިކޭޑާ)، ވެލެރިއާ ޒޯނީ (ވެލެރިއާ ޒޯނީ)، އޮކްސިލިއަޑޯރާ އަގުއިލެރާ-ރޮމެރޯ، އަނާ މާރިއާ ޕެރޭޒް -ލިނެރޯ)، ސާޖިއޯ ލޮޕޭޒް (ސަރޖިއޯ ލޮޕޭޒް)، މިހޯ ވާގާ (މިހޯ ވާގާ)، މިސާކޯ އަރްމާން (މިސާކޯ އަރްމާން)، މިޔާކޯ ރިމާން (މިޔާކޯ ރިމާން)، ޕްރޮއު އަކިރާ، ސްޓެފަނޯ ފަނީ، އަކިހިކޯ ނަކާނޯ، މެނުއަލް މުނީޒް އެވެ
3ޑީ ހައި ރިޒޮލިއުޝަން ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ އިން ސެލެކްޓިވް އައުޓްޕުޓް ސައިޓްތަކުގައި ޕްރޮޓީން ސޯރޓިންގ އަށް ސެރަމައިޑް ޗޭން ލެންގްސްގެ މުހިންމުކަން ހާމަވެއެވެ.
ސޯފިއާ ރޮޑްރިގޭޒް-ގަލާޑޯ، ކާޒޫއޯ ކުރޯކާވާ، ސުސާނާ ސާބިޑޯ-ބޮޒޯ، އަލެޖެންޑްރޯ ކޯޓެޒް · ގޯމޭޒް (އެލެޖެންޑްރޯ ކޯޓެސް-ގޮމޭޒް)، އަޓްސުކޯ އިކެޑާ (އަޓްސުކޯ އިކޭޑާ)، ވެލެރިއާ ޒޯނީ (ވެލެރިއާ ޒޯނީ)، އޮކްސިލިއަޑޯރާ އަގުއިލެރާ-ރޮމެރޯ، އަނާ މާރިއާ ޕެރޭޒް -ލިނެރޯ)، ސާޖިއޯ ލޮޕޭޒް (ސަރޖިއޯ ލޮޕޭޒް)، މިހޯ ވާގާ (މިހޯ ވާގާ)، މިސާކޯ އަރްމާން (މިސާކޯ އަރްމާން)، މިޔާކޯ ރިމާން (މިޔާކޯ ރިމާން)، ޕްރޮއު އަކިރާ، ސްޓެފަނޯ ފަނީ، އަކިހިކޯ ނަކާނޯ، މެނުއަލް މުނީޒް އެވެ
3ޑީ ހައި ރިޒޮލިއުޝަން ރިއަލް ޓައިމް އިމޭޖިންގ އިން ސެލެކްޓިވް އައުޓްޕުޓް ސައިޓްތަކުގައި ޕްރޮޓީން ސޯރޓިންގ އަށް ސެރަމައިޑް ޗޭން ލެންގްސްގެ މުހިންމުކަން ހާމަވެއެވެ.
©2020 އެމެރިކަން އެސޯސިއޭޝަން ފޯރ ދަ އެޑްވާންސްމަންޓް އޮފް ސައިންސް. ހުރިހާ ހައްޤުތަކެއް ލިބިގެންވެއެވެ. އޭއޭއޭއެސް އަކީ ހިނާރީ، އަގޯރާ، އޮއާރޭ، ކޯރަސް، ކްލޮކްސްއެސް، ކްރޮސްރެފް އަދި ކައުންޓަރުގެ ޕާޓްނަރެކެވެ. ސައިންސްއެޑްވާންސެސް އައިއެސްއެސްއެން 2375-2548.