އިމިއުނޯމޮޑިއުލޭޓަރީ މެޓަބޮލައިޓްސް އަކީ ޓިއުމަރ މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓް (ޓީއެމްއީ) ގެ މުހިއްމު ސިފައެއް ނަމަވެސް މަދު ކަންތައްތަކެއް އިސްތިސްނާކޮށް، އެމީހުންގެ އައިޑެންޓިޓީތައް ބޮޑުތަނުން ނޭނގެއެވެ. މިތަނުގައި، އަޅުގަނޑުމެން ހައި ގްރޭޑް ސީރަސް ކާސިނޯމާ (އެޗްޖީއެސްސީ) ޖެހިފައިވާ ބަލިމީހުންގެ ޓިއުމަރާއި އެސިޓިސް އިން ޓިއުމަރާއި ޓީ ސެލްތައް ތަޙުލީލުކޮށް، މި ތަފާތު ޓީއެމްއީ ކޮމްޕާރޓްމަންޓްތަކުގެ މެޓަބޮލޯމް ހާމަކުރިން. އެސިޓިސް އާއި ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި މެޓަބޮލައިޓް ތަފާތުތައް ވަރަށް ބޮޑަށް ހުރެއެވެ. އެސައިޓްސް އާއި އަޅާބަލާއިރު ޓިއުމަރ އަށް ވަދެގެންދާ ޓީ ސެލްތަކުގައި 1-މެތައިލްނިކޮޓިނަމައިޑް (MNA) އިން ވަރަށް ބޮޑަށް މުއްސަނދިވެފައިވެއެވެ. ޓީ ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭގެ މިންވަރު މަތިވި ނަމަވެސް، ނިކޮޓިނަމައިޑް އެން-މެތައިލްޓްރާންސްފެރޭޒް (އެސް-އެޑެނޮސިލްމެތިއޮނިން އިން ނިކޮޓިނަމައިޑަށް މެތައިލް ގްރޫޕްތައް ބަދަލުވުމަށް ކެޓަލައިޒް ކުރާ އެންޒައިމް) ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ފައިބްރޯބްލާސްޓްސް އަދި ޓިއުމަރ ސެލްތަކަށް ނިސްބަތްވެއެވެ. ފަންކްޝަނަލް ގޮތުން އެމްއެންއޭ އިން ޓީ ސެލްތަކުން ޓިއުމަރ ޕްރޮމޯޓިންގ ސައިޓޮކިން ޓިއުމަރ ނެކްރޮސިސް ފެކްޓަރ އަލްފާ ސެކްރެޓް ކުރެއެވެ. އެހެންކަމުން ޓީއެމްއީ އިން އުފެދިފައިވާ އެމްއެންއޭ އަކީ ޓީ ސެލްތަކުގެ ދިފާއީ ނިޒާމު ރެގިއުލޭޓް ކުރުމަށް އެހީތެރިވެދޭ އަދި އިންސާނާގެ ކެންސަރަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ޕޮޓެންޝަލް އިމިއުނޯތެރަޕީ ޓާގެޓެއް ތަމްސީލުކުރާ އެއްޗެކެވެ.
ޓިއުމަރ އިން އުފައްދާ މެޓަބޮލައިޓްސް އިން އެންޓި ޓިއުމަރ އިމިއުނިޓީއަށް ފުން އިންހިބިޓޯރީ އަސަރެއް ކޮށްފާނެ ކަމަށާއި، ގިނަ ހެކިތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އެއީ ބަލި ކުރިއެރުމަށް މުހިއްމު ދުއްވާ ބާރެއްގެ ގޮތުގައި ވެސް ބޭނުންކުރެވިދާނެ އެއްޗެކެވެ (1). ވާރބަރގް އިފެކްޓްގެ އިތުރުން ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ސްޓޭޓާއި ޓިއުމަރ މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓް (ޓީއެމްއީ) ގެ އިމިއުން ސްޓޭޓް އާއި އޭގެ ގުޅުން ސިފަކުރުމަށް ފަހުގެ މަސައްކަތްތައް ވަނީ ފަށާފައެވެ. މައުސް މޮޑެލްތަކާއި އިންސާނާގެ ޓީ ސެލްތަކާ ބެހޭ ދިރާސާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ގްލޫޓާމިން މެޓަބޮލިޒަމް (2)، އޮކްސިޑޭޓިވް މެޓަބޮލިޒަމް (3) އަދި ގްލޫކޯޒް މެޓަބޮލިޒަމް (4) އަކީ އެކި ދިފާއީ ސެލް ސަބްގްރޫޕްތަކަށް މިނިވަންކަމާއެކު އަމަލުކުރެވޭނެ އެއްޗެކެވެ. މި މަގުތަކުގައި ހިމެނޭ ބައެއް މެޓަބޮލައިޓްތަކުން ޓީ ސެލްތަކުގެ އެންޓި ޓިއުމަރ ފަންކްޝަން ހުއްޓުވައެވެ. ކޯއެންޒައިމް ޓެޓްރަހައިޑްރޯބަޔޮޕްޓެރިން (BH4) ބްލޮކޭޑް ވުމުން ޓީ ސެލްތައް ގިނަވުމަށް ގެއްލުން ލިބި، ހަށިގަނޑުގައި ބީއެޗް4 އިތުރުވުމުން ސީޑީ4 އަދި ސީޑީ8 މެދުވެރިކޮށް އެންޓި ޓިއުމަރ އިމިއުން ރިސްޕޮންސް އިތުރުވެދާނެކަން ސާބިތުވެފައިވެއެވެ. މީގެ އިތުރުން ކިނޫރެނިންގެ އިމިއުނޯ ސަޕްރެސިވް އެފެކްޓް ސަލާމަތް ކުރެވޭނީ ބީއެޗް4 ދިނުމުންނެވެ (5). އައިސޮސައިޓްރޭޓް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް (IDH) މޫޓޭންޓް ގްލިއޯބްލަސްޓޯމާގައި އެނަންޓިއޯމެޓަބޮލިކް (R)-2-ހައިޑްރޮކްސީގްލޫޓޭރޭޓް (R-2-HG) ގެ ސެކްރެޝަން އިން ޓީ ސެލް އެކްޓިވޭޝަން، ޕްރޮލިފަރޭޝަން އަދި ސައިޓޮލައިސިސް އެކްޓިވިޓީ ހުއްޓުވައެވެ (6). ފަހަކަށް އައިސް ގްލައިކޮލައިސިސްގެ ބައި-ޕްރޮޑަކްޓެއް ކަމަށްވާ މެތައިލްގްލައިއޮކްސަލް އުފައްދަނީ މައިލޯއިޑް އޮރިޖިންގެ ސަޕްރެސަރ ސެލްތަކުން ކަމަށާއި، މެތައިލްގްލައިއޮކްސަލްގެ ޓީ ސެލް ޓްރާންސްފާ އިން އިފެކްޓަރ ޓީ ސެލްގެ މަސައްކަތް ހުއްޓުވޭނެ ކަމަށް ދައްކާފައިވެއެވެ. ފަރުވާގައި މެތައިލްގްލައިއޮކްސަލް ނިއުޓްރަލައިޒޭޝަން ކުރުމުން މައިލޯއިޑް ޑައިރެވިޑް ސަޕްރެސަރ ސެލްސް (MDSC) ގެ ހަރަކާތްތަކުން އަރައިގަނެ، މައުސް މޮޑެލްތަކުގައި ޗެކްޕޮއިންޓް ބްލޮކޭޑް ތެރަޕީ ސިނަޖިސްޓިކަލީ އިތުރުކުރެވިދާނެއެވެ (7). މި ދިރާސާތަކުން ޖަމާޢަތުގައި ބާރުއަޅަނީ ޓީ ސެލްގެ ފުންކްޝަން އަދި އެކްޓިވިޓީ ރެގިއުލޭޓް ކުރުމުގައި ޓީއެމްއީ އިން އުފައްދާ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ މުހިއްމު ދައުރަކަށެވެ.
އޯވަރީ ކެންސަރުގައި ޓީ ސެލް ޑިސްފެންޝަން ގިނައިން ރިޕޯޓްކޮށްފައިވެއެވެ (8). މިއީ ބައެއް ގޮތްގޮތުން ހައިޕޮކްސިއާ އާއި އާދަޔާ ހިލާފު ޓިއުމަރ ވެސްކިއުލެޗަރ (9) ގައި އެކުލެވޭ މެޓަބޮލިކް ސިފަތަކުގެ ސަބަބުން ގްލޫކޯޒް އާއި ޓްރިޕްޓޯފަން ލެކްޓިކް އެސިޑް އަދި ކިނޫރެނިން ފަދަ ބައި-ޕްރޮޑަކްޓްތަކަށް ބަދަލުވުމެވެ. މާގިނައިން އެކްސްޓްރާސެލިއުލަރ ލެކްޓޭޓް ބޭނުންކުރުމުން އިންޓަރފެރޯން-γ (IFN-γ) އުފެއްދުން މަދުވެ، މައިލޯސަޕްރެސިވް ސަބްގްރޫޕްތަކުގެ ތަފާތުވުން ދުއްވާލައެވެ ( 10 , 11 ). ޓްރިޕްޓޯފަން ބޭނުންކުރުމުން ސީދާ ޓީ ސެލް ޕްރޮލިފަރޭޝަން ހުއްޓުވައި ޓީ ސެލް ރިސެޕްޓަރ ސިގްނަލިންގ ހުއްޓުވައެވެ (12-14). މި ތަޙުލީލުތައް ކުރި ނަމަވެސް، އިން ވިޓްރޯ ޓީ ސެލް ކަލްޗަރގައި އޮޕްޓިމައިޒްޑް މީޑިއާ ބޭނުންކޮށްގެން، ނުވަތަ އިން ވިވޯގައި ހޯމޮލޮގަސް މައުސް މޮޑެލްތަކަށް ލިމިޓްކޮށް، އިމިއުން މެޓަބޮލިޒަމް ވަށައިގެން ގިނަ މަސައްކަތްތަކެއް ކުރެވުނެވެ.
އޯވަރީ ކެންސަރުގެ އާންމު ސިފައަކީ ޕެރިޓޯނިއަލް ސްޕްރެޑް އާއި އެސިޓިސް ފެނުމެވެ. އެސިޓިސް ގައި ސެލް ފްލޫޑް އެއްވުމަކީ ބަލި ކުރިއަރާފައިވާ އަދި ޕްރޮގްނޯސިސް ދަށްވުމާ ގުޅުންހުރި ކަމެކެވެ ( 15 ). ރިޕޯޓްތައް ބުނާގޮތުން މި ޔުނިކް ކޮމްޕާރޓްމަންޓަކީ ހައިޕޮކްސިކް ކޮމްޕާރޓްމަންޓަކަށް ވާއިރު، ވެސްކިއުލަރ އެންޑޯތެލިއަލް ގްރޯތް ފެކްޓަރ (VEGF) އަދި އިންޑޯލިއަމިން 2،3-ޑައިއޮކްސިޖެނެޒް (IDO) ގެ މިންވަރު މަތިވެ، ޓީ ރެގިއުލޭޓަރީ ސެލްތަކާއި މައިލޯއިޑް އިންހިބިޓޯރީ ސެލްތަކުން ވަދެއެވެ (15-18). އެސިޓިސްގެ މެޓަބޮލިކް މާހައުލު ޚުދު ޓިއުމަރުގެ މާހައުލާ ތަފާތުވެދާނެތީ، ޕެރިޓޯނިއަލް ސްޕޭސްގައި ޓީ ސެލްތައް ރީޕްރޮގްރާމް ކުރުން ސާފެއް ނުވެއެވެ. މީގެ އިތުރުން ޓިއުމަރުގެ މާހައުލުގައި ހުންނަ އެސައިޓްސް އާއި މެޓަބޮލައިޓްސް އާއި ދެމެދު ހުންނަ މުހިއްމު ތަފާތުތަކާއި ހެޓަރޮޖެނިޓީގެ ސަބަބުން ދިފާއީ ސެލްތައް ވަދެ ޓިއުމަރުތަކަށް އެސެލްތަކުގެ މަސައްކަތްތަކަށް ހުރަސްއެޅިދާނެ ކަމަށާއި، އިތުރު ދިރާސާތަކެއް ކުރަން ޖެހޭ ކަމަށެވެ.
މި މައްސަލަތައް ހައްލުކުރުމަށްޓަކައި، ތަފާތު ސެލް ވައްތަރުތައް (ސީޑީ4 + އަދި ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތައް ހިމެނޭ) އަދި ޓިއުމަރުގެ ތެރޭގައި އަދި ޓިއުމަރުގެ މެދުގައި ދިރާސާކުރުމަށް ނާޒުކު ސެލް ސެޕަރޭޝަން އަދި ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ ޓެންޑަމް މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީ (އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް) މެތެޑެއް ފަރުމާކުރިން. އަޅުގަނޑުމެން މި އުސޫލު ބޭނުންކުރަނީ ހައި-ޑައިމަންޝަނަލް ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އާއި ސިންގަލް-ސެލް އާރްއެންއޭ ސިކުއެންސިންގ (scRNA-seq) އާއި ގުޅިގެން މި ކީ ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ސްޓޭޓަސްގެ ވަރަށް ރިޒޮލިއުޓް ޕޯޓްރެއިޓެއް ފޯރުކޮށްދިނުމަށެވެ. މި އުސޫލުން ޓިއުމަރ ޓީ ސެލްތަކުގައި 1-މެތައިލްނިކޮޓިނަމައިޑް (MNA) ގެ މިންވަރު ވަރަށް ބޮޑަށް އިތުރުވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވުނުއިރު، އިން ވިޓްރޯ ތަޖުރިބާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓީ ސެލްގެ ވަޒީފާއަށް އެމްއެންއޭގެ އިމިއުނޯމޮޑޫލޭޓަރީ އަސަރު ކުރިން ނޭނގެއެވެ. އާންމު ގޮތެއްގައި މި އުސޫލުން ޓިއުމަރުތަކާއި ދިފާޢީ ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ހިނގާ މެޓަބޮލިކް މުޢާމަލާތްތައް ހާމަވެ، ޓީ ސެލް އަށް ބިނާކޮށް އޯވަރީ ކެންސަރަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ބޭނުންތެރި ވެދާނެ ދިފާޢީ ނިޒާމު ރެގިއުލޭޝަން މެޓަބޮލައިޓްތަކާ ބެހޭ ޚާއްޞަ ވިސްނުންތަކެއް ލިބިގެންދެއެވެ.
އަޅުގަނޑުމެން އެއްފަހަރާ ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ބޭނުންކުރީ ހައި-ޑައިމަންޝަނަލް ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7، 19، 20) އެއްފަރާތެއްގައި ޓިޕިކަލް އެވެ އިމިއުން ސެލްތަކާއި ޓިއުމަރ ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތައް ތަފާތުކުރާ މާކެރސް (ތާވަލް S2 އަދި ފޮޓޯ S1A) އެވެ. މި ތަޙުލީލުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓީ ސެލްތަކާ އަޅާބަލާއިރު އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރު މަތި ނަމަވެސް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީގައި ކުދިކުދި ތަފާތުތަކެއް ހުރެއެވެ. ޓިއުމަރ ސެލްތަކުން [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ގެ އެވްރެޖް ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރަކީ ޓީ ސެލްތަކުގެ ތިންގުނައާއި ހަތަރު ގުނައާއި ދެމެދުގެ އަދަދެއް ކަމަށާއި، CD4 + T ސެލްތަކުގެ އެވްރެޖް ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރަކީ CD8 + T ސެލްތަކުގެ އެވްރެޖް ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރަކީ CD8 + T ސެލްތަކުގެ އެވްރެޖް ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރެއް ކަމަށާއި، މިއީ އެއް ޓީއެމްއީގައި ވެސް ޓިއުމަރ އިންފިލްޓްރޭޓިންގ ލިމްފޯސައިޓްސް (TIL) ގެ މެޓަބޮލިކް ރިކުއަރމަންޓްތައް ތަފާތުކަން ދައްކުވައިދޭ ކަމެކެވެ (ފޮޓޯ 1އޭ). މިއާ ޚިލާފަށް ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ CD4 + T ސެލްތަކާ އެއްގޮތް ކަމަށާއި، ދެ ސެލް ވައްތަރުގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ CD8 + T ސެލްތަކަށްވުރެ މަތި ކަމަށް ވެސް ޑރ. އާންމު ގޮތެއްގައި މި ނަތީޖާތަކުން މެޓަބޮލިކް ލެވެލް ހާމަވެއެވެ. ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގެ މެޓަބޮލިކް އެކްޓިވިޓީ ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކަށްވުރެ މަތިވެ، ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކުގެ މެޓަބޮލިކް އެކްޓިވިޓީ ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތަކަށްވުރެ މަތިވެއެވެ. ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައި މި އަސަރުތައް ކުރި ނަމަވެސް، ޓިއުމަރާ އަޅާބަލާއިރު، ސީޑީ4 + އަދި ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ސްޓޭޓަސް ނުވަތަ އެސިޓިސްގައި އެސެލްތަކުގެ ނިސްބަތުން ތަފާތު ނިސްބަތްތަކުގައި އެއްގޮތަކަށް ތަފާތެއް ނުފެނެއެވެ (ފޮޓޯ 1ސީ). މިއާ ޚިލާފަށް ސީޑީ45-ސެލް ފްރެކްޝަންގައި ޓިއުމަރުގައި ހުންނަ EpCAM+ ސެލްތަކުގެ ނިސްބަތް އެސައިޓްސް އާއި އަޅާބަލާއިރު އިތުރުވެއެވެ ( ފޮޓޯ 1ޑީ ). އަދި EpCAM+ އަދި EpCAM- ސެލް ކޮމްޕޯނެންޓްތަކުގެ މެދުގައި ސާފު މެޓަބޮލިކް ތަފާތެއް އަޅުގަނޑުމެންނަށް ފާހަގަކުރެވުނެވެ. EpCAM+ (ޓިއުމަރ) ސެލްތަކުގައި EpCAM- ސެލްތަކަށްވުރެ ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ މަތިވާއިރު، މިއީ ޓީއެމްއީގައިވާ ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި ހުންނަ ފައިބްރޯބްލާސްޓްސްގެ މެޓަބޮލިކް އެކްޓިވިޓީއަށްވުރެ މާ މަތީ އަދަދެކެވެ ( ފޮޓޯ 1، އީ އަދި އެފް ).
(އޭ އަދި ބީ) މީޑިއަން ފްލޫރެސެންސް އިންޓެންސިޓީ (އެމްއެފްއައި) ގެ ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް (2-އެންބީޑީޖީ) (އޭ) އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ އޮފް ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްސް (މައިޓޯޓްރެކަރ ޑާކް ރެޑް) (ބީ) ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ގްރާފްސް (ކަނާތް) އަދި ޖަދުވަލުކޮށްފައިވާ ޑޭޓާ (ވާތް)، ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްސް އަދި އެސިޓީސް އަދި ޓިއުމަރ އިން ލިބުނު EpCAM + CD45-ޓިއުމަރ ސެލްސް. (ސ) އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރ ގައި CD4 + އަދި CD8 + ސެލްސް (ސީޑީ3 + ޓީ ސެލްތަކުގެ) ގެ ނިސްބަތް. (ޑ) އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރ (CD45−) ގައި ހުންނަ EpCAM + ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގެ ނިސްބަތް. (އީ އަދި އެފް) EpCAM + CD45-tumor އަދި EpCAM-CD45-matrix ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް (2-NBDG) (E) އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ (MitoTracker ޑާކް ރެޑް) (F) ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް ގްރާފްސް (ކަނާތް) އަދި ޖަދުވަލުކޮށްފައިވާ ޑޭޓާ ( ވާތް) އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރ ސެލްސް. (ގ) ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އިން CD25، CD137 އަދި PD1 އެކްސްޕްރެޝަންގެ ތަމްސީލު ގްރާފްތައް. (އެޗް އަދި އައި) ސީޑީ25، ސީޑީ137 އަދި ޕީޑީ1 އެކްސްޕްރެޝަން ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްސް (އެޗް) އަދި ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްސް (އައި) ގައި. (ޖޭ އަދި ކޭ) ސީސީއާރު7 އަދި ސީޑީ45އާރުއޯގެ އެކްސްޕްރެޝަނަށް ބިނާކޮށް ނޭއިވް، ސެންޓްރަލް މެމޮރީ (ޓީސީއެމް)، އިފެކްޓަރ (ޓެފް) އަދި އިފެކްޓަރ މެމޮރީ (ޓެމް) ފީނޯޓައިޕްސް. އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރުތަކުގައި ހުންނަ ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްސް (ޖޭ) އަދި ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްސް (ކޭ) ގެ ރިޕްރެޒެންޓޭޓިވް އިމޭޖްސް (ކަނާތް) އަދި ޓޭބަލް ޑޭޓާ (ވާތް) . ޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓުން ކަނޑައެޅޭ ޕީ ވެލިއުސް (*P<0.05، **P<0.01 އަދި ***P<0.001) އެވެ. މި ރޮނގުން ދައްކުވައިދެނީ އެއްގޮތް ބަލިމީހުން (n = 6) އެވެ. އެފްއެމްއޯ، ފްލޫރެސެންސް މައިނަސް އެއް؛ އެމްއެފްއައި، މީޑިއަން ފްލޫރެސެންސް އިންޓެންސިޓީ.
އިތުރަށް ތަޙުލީލު ކުރުމުން ފާހަގަކުރެވުނީ ވަރަށް ބޮޑަށް ރިޒޮލިއުޓް ވެފައިވާ ޓީ ސެލް ފީނޯޓައިޕިކް ސްޓޭޓަސް އާއި ދެމެދު ފާހަގަކޮށްލެވޭ އެހެން ތަފާތުތަކެކެވެ. ޓިއުމަރުތަކުގައި އެކްޓިވޭޓް ކުރެވިފައިވާ (ފޮޓޯ 1، ޖީ އިން އައި) އަދި އިފެކްޓަރ މެމޮރީ (ފޮޓޯ 1، ޖޭ އަދި ކޭ) އަކީ އެސައިޓްސް (ސީޑީ3 + ޓީ ސެލްސްގެ ނިސްބަތް) އަށްވުރެ މާ ގިނައިން ފެންނަ އެއްޗެކެވެ. ހަމައެފަދައިން، އެކްޓިވޭޝަން މާކެރސް (CD25 އަދި CD137) އަދި ޑިޕްލީޝަން މާކެރސް [ޕްރޮގްރާމްޑް ސެލް ޑެތު ޕްރޮޓީން 1 (PD1)] ގެ އެކްސްޕްރެޝަން އިން ފީނޯޓައިޕް ތަޙުލީލުކުރުމުން މި ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކުގެ މެޓަބޮލިކް ސިފަތައް ތަފާތު ނަމަވެސް (ފޮޓޯ S1، B އިން E) , އެކަމަކު ނޭއިވް، އިފެކްޓަރ ނުވަތަ މެމޮރީ ސަބްސެޓްތަކުގެ މެދުގައި މާބޮޑު މެޓަބޮލިކް ތަފާތެއް އެއްގޮތަކަށްވެސް ނުފެނެއެވެ (ފޮޓޯ S1، F އިން I). މި ނަތީޖާތައް ކަށަވަރުކޮށްދިނީ މެޝިން ލާރނިންގ މެތެޑްސް ބޭނުންކޮށްގެން އޮޓޮމެޓިކުން ސެލް ފީނޯޓައިޕްސް (21) ޙަވާލުކުރުމުން، މިކަމުން އިތުރަށް ހާމަވެގެން ދިޔައީ ބަލިމީހާގެ އެސިޓިސްގައި ގިނަ އަދަދެއްގެ ބޯންމެރޯ ސެލްސް (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ހުރިކަން (ފޮޓޯ S2A) އެވެ. ފާހަގަކުރެވުނު ހުރިހާ ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ ތެރެއިން މި މައިލޯއިޑް ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަން އިން އެންމެ ގިނައިން ގްލޫކޯޒް ނަގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ ފެނިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ S2، B އިން G). މި ނަތީޖާތަކުން ހާމަވަނީ އެޗްޖީއެސްސީ ބަލިމީހުންގެ އެސިޓިސް އާއި ޓިއުމަރުތަކުގައި ހުންނަ ގިނަ ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައި ހުންނަ ވަރުގަދަ މެޓަބޮލިކް ތަފާތުތަކެވެ.
ޓީއައިއެލްގެ މެޓަބޮނޮމިކް ސިފަތައް ދެނެގަތުމަށް އޮތް މައިގަނޑު ގޮންޖެހުމަކީ ޓިއުމަރުތަކުން އެކަށީގެންވާ ސާފުކަމާއި ފެންވަރާއި މިންވަރުގެ ޓީ ސެލް ސާމްޕަލްތައް އެކަހެރިކުރަން ޖެހުމެވެ. ފަހުގެ ދިރާސާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީއަށް ބިނާކޮށް ސޯރޓިންގ އަދި ބީޑް އެންރިޗްމަންޓް މެތެޑްސް ގެ ސަބަބުން ސެލްއުލަރ މެޓަބޮލައިޓް ޕްރޮފައިލްތަކަށް ބަދަލުތަކެއް އަތުވެދާނެ (22-24). މި މައްސަލައިން އަރައިގަތުމަށްޓަކައި، އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް އިން ތަޙުލީލު ކުރުމުގެ ކުރިން، ސާޖިކަލީ ރިސެކްޓް ކުރެވިފައިވާ އިންސާނާގެ އޯވަރީ ކެންސަރުން ޓީއައިއެލް އެކަހެރިކޮށް އެކަހެރިކުރުމަށް ބީޑް އެންރިޗްމަންޓް މެތޯޑް އޮޕްޓިމައިޒް ކުރިން (މެޓީރިއަލްސް އެންޑް މެތޯޑްސް ބައްލަވާ؛ ފޮޓޯ 2އޭ). މި ޕްރޮޓޮކޯލްގެ ޖުމްލަ އަސަރު މެޓަބޮލައިޓް ބަދަލުތަކަށް ކުރާ މިންވަރު ވަޒަންކުރުމަށްޓަކައި، މަތީގައިވާ ބީޑް ވަކިކުރުމުގެ ފިޔަވަޅަށްފަހު ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރުން އެކްޓިވޭޓްކުރި ޓީ ސެލްތަކުގެ މެޓަބޮލައިޓް ޕްރޮފައިލްތައް ބީޑް ވަކިނުވި ނަމަވެސް އައިސް މަތީގައި ހުރި ސެލްތަކާ އަޅާކިޔައިފިން. މި ކޮލިޓީ ކޮންޓްރޯލް އެނަލިސިސް އިން މި ދެ ޝަރުޠުގެ މެދުގައި ބޮޑު ގުޅުމެއް އޮތްކަން ފާހަގަކުރެވުނު (r = 0.77)، އަދި 86 މެޓަބޮލައިޓްގެ ގްރޫޕްގެ ޓެކްނިކަލް ރިޕީޓެބިލިޓީގައި ރިޕީޓެބިލިޓީ މަތިކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ (ފޮޓޯ 2ބީ). އެހެންކަމުން މި ގޮތްތަކުގެ ސަބަބުން ސެލް ޓައިޕް އެންރިޗްމަންޓް ކުރާ ސެލްތަކުގައި ޞައްޙަ މެޓަބޮލައިޓް އެނަލިސިސް ހެދި، އެޗްޖީއެސްސީގައި ހުންނަ ވަކި މެޓަބޮލައިޓްތައް ދެނެގަތުމަށް ފުރަތަމަ ހައި ރިޒޮލިއުޝަން ޕްލެޓްފޯމް ލިބިގެންދެއެވެ.
(އ) މެގްނެޓިކް ބީޑް އެންރިޗްމަންޓްގެ ސްކީމެޓިކް ޑައިގްރާމް. އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް އިން ތަހުލީލު ކުރުމުގެ ކުރިން ސެލްތައް ޖެހިޖެހިގެން ތިން ބުރެއްގެ މެގްނެޓިކް ބީޑް އެންރިޗްމަންޓް ކުރާނެ ނުވަތަ އައިސް މަތީގައި ހުންނާނެ އެވެ. (ބ) މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ގިނަކަމަށް އެންރިޗްމަންޓް ޓައިޕްގެ އަސަރު. ކޮންމެ އެންރިޗްމަންޓް ޓައިޕަކަށް ތިން މިންކުރުމުގެ އެވްރެޖް ± އެސްއީ. އަޅި ކުލައިގެ ރޮނގުން ދައްކުވައިދެނީ 1:1 ގެ ގުޅުމެކެވެ. އެކްސިސް ލޭބަލްގައި ދައްކާފައިވާ ތަކުރާރުކޮށް މިންކުރުމުގެ އިންޓްރާ ކްލާސް ކޯރިލޭޝަން (އައިސީސީ) އެވެ. އެންއޭޑީ، ނިކޮޓިނަމައިޑް އެޑެނިން ޑައިނިއުކްލިއޯޓައިޑް އެވެ. (ސ) ބަލިމީހާގެ މެޓަބޮލައިޓް ތަޙުލީލުކުރުމުގެ ވޯކްފްލޯގެ ސްކީމެޓިކް ޑައިގްރާމް. އެސިޓިސް ނުވަތަ ޓިއުމަރު ބަލިމީހުންގެ އަތުން އެއްކޮށް ކްރައިއޯޕްރިޒަރވް ކުރެއެވެ. ކޮންމެ ސާމްޕަލެއްގެ ކުޑަ ބައެއް ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އިން ތަޙުލީލު ކުރިއިރު، ބާކީ ހުރި ސާމްޕަލްތަކުގައި ސީޑީ4+، ސީޑީ8+ އަދި ސީޑީ45- ސެލްތަކަށް ތިން ބުރެއްގެ އެންރިޗްމަންޓް ހެދިއެވެ. މި ސެލް ފްރެކްޝަންތައް ތަޙުލީލުކޮށްފައިވަނީ އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. (ޑ) ސްޓޭންޑަރޑައިޒްޑް މެޓަބޮލައިޓް ގިނަވުމުގެ ހީޓް މެޕް. ޑެންޑްރޯގްރާމް އިން ދައްކުވައިދެނީ ސާމްޕަލްތަކުގެ މެދުގައިވާ ޔޫކްލިޑިއަން ދުރުމިންތައް ވޯޑް ކްލަސްޓަރ ކުރުމެވެ. (އީ) ސާމްޕަލް މެޓަބޮލައިޓް މެޕްގެ ޕްރިންސިޕަލް ކޮމްޕޮނެންޓް އެނަލިސިސް (ޕީސީއޭ)، ކޮންމެ ސާމްޕަލެއްގެ ތިން ރިޕްލިކޭޓް ދައްކާ، އެއް ބަލިމީހެއްގެ ސާމްޕަލްތައް ލައިނަކުން ގުޅިފައިވެއެވެ. (ފ) ބަލިމީހާއަށް ކޮންޑިޝަން ކުރެވިފައިވާ ސާމްޕަލްގެ މެޓަބޮލައިޓް ޕްރޮފައިލްގެ ޕީސީއޭ (އެބަހީ، ޕާރޝިއަލް ރިޑަންޑަންސީ ބޭނުންކޮށްގެން)؛ ސާމްޕަލް ވައްތަރު ލިމިޓް ކުރެވެނީ ކޮންވެކްސް ހާލް އިންނެވެ. ޕީސީ1، މައިގަނޑު ކޮމްޕޮނެންޓް 1؛ ޕީސީ2، މައިގަނޑު ކޮމްޕޮނެންޓް 2.
ދެން މި އެންރިޗްމަންޓް މެތޯޑް ބޭނުންކޮށްގެން އެޗްޖީއެސްސީގެ ހަ ބަލިމީހުންގެ ޕްރައިމަރީ އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރުގައި ހުންނަ CD4 +، CD8 + އަދި CD45-ސެލް ފްރެކްޝަންތަކުގައި ހުންނަ 99 މެޓަބޮލައިޓް ތަޙުލީލުކުރިން (ފޮޓޯ 2ސީ، ފޮޓޯ S3A އަދި ތާވަލް S3 އަދި S4) އެވެ. ޝައުގުވެރިކަން ހުންނަ އާބާދީއަކީ ދިރިހުރި ސެލްތަކުގެ އަސްލު ބޮޑު ސާމްޕަލްގެ %2 އާއި %70 އާއި ދެމެދުގެ އަދަދެއް ކަމަށާއި، ބަލިމީހުންގެ މެދުގައި ސެލްތަކުގެ ނިސްބަތް ވަރަށް ބޮޑަށް ތަފާތުވެއެވެ. ބީޑްސް ވަކިކުރުމަށްފަހު، އެވްރެޖްކޮށް ސާމްޕަލްގައި ހިމެނޭ ހުރިހާ ދިރިހުރި ސެލްތަކުގެ %85 އަށްވުރެ ގިނައީ އެންރިޗްޑް ފްރެކްޝަން އޮފް އިންޓަރެސްޓް (CD4+، CD8+ ނުވަތަ CD45-) އެވެ. މި އެންރިޗްމަންޓް މެތެޑުގެ ސަބަބުން އިންސާނާގެ ޓިއުމަރ ޓިޝޫ މެޓަބޮލިޒަމް އިން ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތައް ތަޙުލީލު ކުރެވޭއިރު، މިއީ ބޮޑެތި ސާމްޕަލްތަކުން ކުރެވޭނެ ކަމެއް ނޫނެވެ. މި ޕްރޮޓޮކޯލް ބޭނުންކޮށްގެން އަޅުގަނޑުމެން ކަނޑައެޅީ އެލް-ކައިނިއުރެނިން އަދި އެޑިނޯސިން، މި ދެ އިމިއުނޯސަޕްރެސިވް މެޓަބޮލައިޓް ޓިއުމަރ ޓީ ސެލް ނުވަތަ ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި މަތިވެފައިވާކަމެވެ (ފޮޓޯ S3، B އަދި C). އެހެންކަމުން މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކުވައިދެނީ ބަލިމީހާގެ ޓިޝޫތަކުގައި ބަޔޮލޮޖިކަލީ މުހިންމު މެޓަބޮލައިޓްތައް ހޯދުމަށް އަޅުގަނޑުމެންގެ ސެލް ވަކިކުރުމާއި މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީ ޓެކްނޮލޮޖީގެ ވަފާތެރިކަމާއި ޤާބިލުކަމެވެ.
އަޅުގަނޑުމެންގެ ތަޙުލީލުން ވެސް ބަލިމީހުންގެ ތެރޭގައި އަދި ބަލިމީހުންގެ މެދުގައި ސެލް ވައްތަރުތައް ވަރުގަދަ މެޓަބޮލިކް ވަކިވުމެއް ފެނިފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 2ޑީ އަދި ފޮޓޯ S4A ). ޚާއްޞަކޮށް، އެހެން ބަލިމީހުންނާ އަޅާބަލާއިރު، ބަލިމީހާ 70 ގައި ތަފާތު މެޓަބޮލިކް ސިފަތައް ފެނިފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 2އީ އަދި ފޮޓޯ S4B)، މިއީ ބަލިމީހުންގެ މެދުގައި ބޮޑު މެޓަބޮލިކް ހެޓަރޮޖެނިޓީއެއް ހުރެދާނެކަން ހާމަކޮށްދޭ ކަމެކެވެ. ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ އެހެން ބަލިމީހުންނާ އަޅާބަލާއިރު (1.2 އާއި 2 ލީޓަރާއި ދެމެދުގެ އަދަދެއް؛ ތާވަލް S1) ބަލިމީހާ 70 (80 މިލިލީޓަރު) ގައި އެއްކުރި އެސިޓިސްގެ ޖުމްލަ މިންވަރު ކުޑަކަމެވެ. ޕްރިންސިޕަލް ކޮމްޕޮނެންޓް އެނަލިސިސްގެ ތެރޭގައި އިންޓަރ ޕޭޝަންޓް ހެޓަރޮޖެނިޓީ ކޮންޓްރޯލް ކުރުމުން (މިސާލަކަށް ޕާރޝިއަލް ރިޑަންޑަންސީ އެނަލިސިސް ބޭނުންކޮށްގެން) ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައި އެއްގޮތް ބަދަލުތަކެއް އަންނައިރު، ސެލް ވައްތަރުތަކާއި/ނުވަތަ މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓް މެޓަބޮލައިޓް ޕްރޮފައިލް އަށް ބަލާފައި ސާފުކޮށް އެގްރިގޭޓް ވެއެވެ (ފޮޓޯ 2F ). އެއް މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ތަޙުލީލުތަކުން މި އަސަރުތަކަށް ބާރުއަޅައި، ސެލް ވައްތަރުތަކާއި މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓާ ދެމެދު ބޮޑެތި ތަފާތުތަކެއް ފެނިފައިވެއެވެ. ފާހަގަކޮށްލެވޭ ކަމަކީ އެންމެ ހައްދުފަހަނަޅާފައިވާ ތަފާތަކީ އާންމުކޮށް ސީޑީ45- ސެލްތަކާއި ޓިއުމަރަށް ވަދެގެންދާ ސީޑީ4+ އަދި ސީޑީ8+ ސެލްތަކުގައި މުއްސަނދިވެފައިވާ އެމްއެންއޭ އެވެ (ފޮޓޯ 3އޭ). ސީޑީ4 + ސެލްތަކަށް މި އަސަރު އެންމެ ބޮޑަށް ފެންނައިރު، ސީޑީ8 + ސެލްތަކުގައި ހުންނަ އެމްއެންއޭ އަށް ވެސް މާހައުލުގެ ސަބަބުން ވަރަށް ބޮޑަށް އަސަރުކުރާހެން ހީވެއެވެ. ނަމަވެސް މިއީ މުހިންމު ކަމެއް ނޫން ކަމަށާއި، ސަބަބަކީ ޓިއުމަރ ސީޑީ8+ ސްކޯރސް އަށް އިވެލުއޭޓް ކުރެވޭނީ ހަ ބަލިމީހުންގެ ތެރެއިން އެންމެ ތިން ބަލިމީހުންނަށް ކަމަށް ވާތީއެވެ. އެމްއެންއޭގެ އިތުރުން އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރުގައި ހުންނަ އެކި ވައްތަރުގެ ސެލްތަކުގައި ޓީއައިއެލްގައި ރަނގަޅަށް ސިފަނުކުރެވޭ އެހެން މެޓަބޮލައިޓްތައް ވެސް ތަފާތު ގޮތަކަށް މުއްސަނދިވެއެވެ (ފޮޓޯ S3 އަދި S4). އެހެންކަމުން މި ޑޭޓާތަކުން އިތުރު ދިރާސާތަކަށް އިމިއުނޯމޮޑޫލޭޓަރީ މެޓަބޮލައިޓްސްގެ އުއްމީދީ ސެޓެއް ހާމަވެގެންދެއެވެ.
(އ) އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރ އިން ސީޑީ4+، ސީޑީ8+ އަދި ސީޑީ45- ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭގެ ނޯމަލައިޒްޑް ކޮންޓެންޓް. ބޮކްސް ޕްލޮޓުން ފެންނަނީ މީޑިއަން (ލައިން)، އިންޓަރކުއާޓައިލް ރޭންޖް (ފްރޭމް ހިންޖް) އަދި ޑޭޓާ ރޭންޖް، އިންޓަރކުއާޓައިލް ރޭންޖް (ފްރޭމް ވިސްކަރ) ގެ 1.5 ގުނައާ ހަމައަށެވެ. ޕޭޝަންޓް މެޓީރިއަލްސް އެންޑް މެތޯޑްސްގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ފަދައިން ޕީ ވެލިއު (*P<0.05 އަދި **P<0.01) ކަނޑައެޅުމަށްޓަކައި ބަލިމީހާގެ ލިމާ ވެލިއު ބޭނުންކުރުން. (ބ) އެމްއެންއޭ މެޓަބޮލިޒަމްގެ ސްކީމެޓިކް ޑައިގްރާމް (60). މެޓަބޮލައިޓްސް: އެސް-އެޑެނޮސިލް-1-މެތިއޮނިން؛ އެސްއޭއެޗް، އެސް-އެޑެނޮސިން-1-ހޯމޯސިސްޓައިން؛ އެންއޭ، ނިކޮޓިނަމައިޑް؛ އެމްއެންއޭ، 1-މެތައިލްނިކޮޓިނަމައިޑް؛ 2-ޕީވައި، 1-މެތައިލް- 2-ޕައިރިޑޯން-5-ކާރބޮކްސަމައިޑް؛ 4-ޕީވައި، 1-މެތައިލް-4-ޕައިރިޑޯން-5-ކާރބޮކްސަމައިޑް؛ އެންއާރު، ނިކޮޓިނަމައިޑް ރައިބޯސް؛ އެންއެމްއެން، ނިކޮޓިނަމައިޑް މޮނޮނިއުކްލިއޯޓައިޑް އެވެ. އެންޒައިމްސް (ފެހި): އެންއެންއެމްޓީ، ނިކޮޓިނަމައިޑް އެން-މެތައިލްޓްރާންސްފެރޭޒް؛ SIRT، ސިރްޓޫއިންސް؛ އެންއޭއެމްޕީޓީ، ނިކޮޓިނަމައިޑް ފޮސްފޮރައިބޮސިލް ޓްރާންސްފަރޭޒް؛ އޭއޯއެކްސް1، އެލްޑީހައިޑް އޮކްސިޑޭޒް 1؛ އެންއާރުކޭ، ނިކޮޓިނަމައިޑް ރައިބޯސައިޑް ކިނާޒް؛ އެންއެމްއެންއޭޓީ، ނިކޮޓިނަމައިޑް މޮނޯ ނިއުކްލިއޯޓައިޑް އެޑިނައިލެޓް ޓްރާންސްފަރޭޒް؛ Pnp1، ޕިއުރިން ނިއުކްލިއޯސައިޑް ފޮސްފޮރައިލޭޒް އެވެ. (ސީ) އެސިޓިސް (ގްރޭ) އަދި ޓިއުމަރ (ރަތް؛ n = 3 ބަލިމީހުން) ގެ scRNA-seq ގެ t-SNE. (ޑީ) scRNA-seq ބޭނުންކޮށްގެން ދެނެގަނެވޭ އެކި ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކުގައި އެންއެންއެމްޓީ އެކްސްޕްރެޝަން. (އީ) އެސްކޭ-އޯވީ-3، ހިއުމަން އެމްބްރިއޮނިކް ކިޑްނީ (އެޗްއީކޭ) 293ޓީ، ޓީ ސެލްސް އަދި އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ލިބިފައިވާ ޓީ ސެލްތަކުގައި އެންއެންއެމްޓީ އަދި އޭއޯއެކްސް1 އެކްސްޕްރެސްވުން. ފޯލްޑް ކޮށްފައިވާ އެކްސްޕްރެޝަން ދައްކާފައިވަނީ އެސްކޭ-އޯވީ-3 އަށް ނިސްބަތްކޮށްގެންނެވެ. ސެމް އާއި އެކު އެކްސްޕްރެޝަން ޕެޓަރން ދައްކާފައިވަނީ (n = 6 ހެލްތީ ޑޯނަރސް) އެވެ. 35 އަށްވުރެ ބޮޑު ސީޓީ ވެލިއުތަކަކީ ޑިޓެކްޓެބަލް (ޔޫޑީ) ކަމަށް ބެލެވެއެވެ. (އެފް) 8mM MNA އިން ފަރުވާ ދިން SK-OV-3، HEK293T، T ސެލްސް އަދި ޓީ ސެލްތަކުގައި SLC22A1 އަދި SLC22A2 އެކްސްޕްރެސްވުން. ފޯލްޑް ކޮށްފައިވާ އެކްސްޕްރެޝަން ދައްކާފައިވަނީ އެސްކޭ-އޯވީ-3 އަށް ނިސްބަތްކޮށްގެންނެވެ. ސެމް އާއި އެކު އެކްސްޕްރެޝަން ޕެޓަރން ދައްކާފައިވަނީ (n = 6 ހެލްތީ ޑޯނަރސް) އެވެ. 35 އަށްވުރެ ބޮޑު ސީޓީ ވެލިއުތަކަކީ ޑިޓެކްޓެބަލް (ޔޫޑީ) ކަމަށް ބެލެވެއެވެ. (ގ) އެމްއެންއޭ އާއި އެކު 72 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓުމަށްފަހު އެކްޓިވޭޓް ކުރެވިފައިވާ ހެލްތީ ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތަކުގައި ސެލް އެމްއެންއޭ ކޮންޓެންޓް. ސެމް އާއި އެކު އެކްސްޕްރެޝަން ޕެޓަރން ދައްކާފައިވަނީ (n = 4 ހެލްތީ ޑޯނަރސް) އެވެ.
އެމްއެންއޭ އުފެދެނީ ނިކޮޓިނަމައިޑް އެން-މެތައިލްޓްރާންސްފެރޭޒް (އެންއެންއެމްޓީ؛ ފޮޓޯ 3ބީ) އިން އެސް-އެޑެނޮސިލް-1-މެތިއޮނިން (އެސްއޭއެމް) އިން ނިކޮޓިނަމައިޑް (އެންއޭ) އަށް މެތައިލް ގްރޫޕް ބަދަލުކޮށްގެންނެވެ. އެންއެންއެމްޓީ އަކީ އިންސާނާގެ ތަފާތު ކެންސަރުތަކުގައި މާގިނައިން އެކްސްޕްރެސްވާ އެއްޗަކަށް ވާއިރު، މިއީ ޕްރޮލިފަރޭޝަން، އިންވޭޝަން އަދި މެޓާސްޓޭސިސް އާއި ގުޅުންހުރި އެއްޗެކެވެ (25-27). ޓީއެމްއީގައި ހުންނަ ޓީ ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭގެ މަސްދަރު ރަނގަޅަށް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި، ތިން އެޗްޖީއެސްސީ ބަލިމީހުންގެ އެސިޓްސް އަދި ޓިއުމަރުގައި ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ ތެރެއިން އެންއެންއެމްޓީގެ އެކްސްޕްރެޝަން ސިފަކުރުމަށް scRNA-seq ބޭނުންކުރިން (ތާވަލް S5). ގާތްގަނޑަކަށް 6،500 ސެލްގެ ތަޙުލީލުތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރ މާޙައުލުތަކުގައި އެންއެންއެމްޓީ އެކްސްޕްރެޝަން ޙައްދުވެފައިވަނީ ހީކުރެވޭ ފައިބްރޯބްލާސްޓް އަދި ޓިއުމަރ ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކަށެވެ ( ފޮޓޯ 3، ސީ އަދި ޑީ ). ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ ޕީޓީޕީއާރުސީ (CD45 +) އެކްސްޕްރެސްކުރާ އެއްވެސް ޕޮޕިއުލޭޝަނެއްގައި ފާހަގަކުރެވޭ އެންއެންއެމްޓީ އެކްސްޕްރެޝަނެއް ނެތްކަމެވެ (ފޮޓޯ 3ޑީ އަދި ފޮޓޯ S5A) ކަމަށާއި، މިއީ މެޓަބޮލައިޓް ސްޕެކްޓްރަމްގައި ފާހަގަކުރެވޭ އެމްއެންއޭ ޓީ ސެލްތަކަށް ތަޢާރަފްވެފައިވާކަން ދޭހަވާ ކަމެކެވެ. އެލްޑީހައިޑް އޮކްސިޑޭޒް 1 (AOX1) ގެ އެކްސްޕްރެޝަން އިން އެމްއެންއޭ 1-މެތައިލް-2-ޕައިރިޑޯން-5-ކާރބޮކްސަމައިޑް (2-PYR) ނުވަތަ 1-މެތައިލް-4-ޕައިރިޑޯން-5-ކާރބޮކްސަމައިޑް (4- PYR) އަށް ބަދަލުވެއެވެ؛ ފޮޓޯ 3ބީ) ވެސް ހަނިކުރެވިފައިވަނީ COL1A1 އެކްސްޕްރެސްކުރާ ފައިބްރޯބްލާސްޓްތަކުގެ އާބާދީއަށް (ފޮޓޯ S5A) ކަމަށާއި، މިއީ އެކުގައި ޓީ ސެލްތަކުގައި ކޮންވެންޝަނަލް އެމްއެންއޭ މެޓަބޮލިޒަމްގެ ޤާބިލުކަން ނެތްކަން ދައްކާ އެއްޗެކެވެ. މި އެމްއެންއޭ އާއި ގުޅުންހުރި ޖީންތަކުގެ އެކްސްޕްރެޝަން ޕެޓަރން ޔަގީންކޮށްފައިވަނީ އެޗްޖީއެސްސީ ބަލިމީހުންގެ އެސައިޓްސް އިން ލިބުނު ދެވަނަ މިނިވަން ސެލް ޑޭޓާ ސެޓެއް ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ ( ފޮޓޯ S5B ; n = 6) (16). މީގެ އިތުރުން އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތަކުގެ ކުއަންޓިޓޭޓިވް ޕޮލިމިރޭޒް ޗޭން ރިއެކްޝަން (qPCR) ތަޙުލީލުކުރުމުން ކޮންޓްރޯލް SK-OV-3 އޯވަރިއަން ޓިއުމަރ ސެލްތަކާ އަޅާބަލާއިރު އެންއެންއެމްޓީ ނުވަތަ AOX1 ގާތްގަނޑަކަށް އެކްސްޕްރެސް ނުވާކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ (ފޮޓޯ 3E). މި ހީވެސް ނުކުރާ ނަތީޖާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ފައިބްރޯބްލާސްޓް ނުވަތަ ޓިއުމަރުތަކުން ޓީއެމްއީގައި ހުންނަ ޖެހިގެން ހުންނަ ޓީ ސެލްތަކަށް އެމްއެންއޭ ނިކުމެދާނެ އެވެ.
ކެންޑިޑޭޓުންގެ ތެރޭގައި ސޮލިއުބަލް ކެރިއަރ 22 (SLC22) އާއިލާ (SLC22A1, SLC22A2 އަދި SLC22A3) އިން އިންކޯޑްކޮށްފައިވާ އޯގަނިކް ކެޝަން ޓްރާންސްޕޯޓަރސް 1 އިން 3 (OCT1, OCT2 އަދި OCT3) ގެ އާއިލާ ހިމެނޭ ނަމަވެސް، އެމްއެންއޭގެ ޕޮޓެންޝަލް ޓްރާންސްޕޯޓަރސް އަދިވެސް ކަނޑައެޅިފައެއް ނުވެއެވެ (28) . ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތަކުން ލިބުނު އެމްއާރްއެންއޭގެ ކިއުޕީސީއާރު އިން SLC22A1 ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ލެވެލް ދަށް ނަމަވެސް SLC22A2 ގެ ޑިޓެކްޓެބަލް ލެވެލް ފެނިފައިވާއިރު، މިއީ ކުރިން ލިޓަރޭޗަރގައި ރިޕޯޓްކޮށްފައިވާކަން ކަށަވަރުކޮށްދޭ ކަމެކެވެ ( ފޮޓޯ 3F ) (29). މިއާ ޚިލާފަށް އެސްކޭ-އޯވީ-3 އޯވަރިއަން ޓިއުމަރ ސެލް ލައިން އިން ދެ ޓްރާންސްޕޯޓަރ ވެސް މަތީ މިންވަރަކަށް އެކްސްޕްރެސް ވެއެވެ ( ފޮޓޯ 3އެފް ).
ޓީ ސެލްތަކުގައި ބޭރުގެ އެމްއެންއޭ ޖަހައިގަތުމުގެ ޤާބިލުކަން ހުރިތޯ ބެލުމަށްޓަކައި، ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތައް އެމްއެންއޭގެ ތަފާތު ކޮންސެންޓްރޭޝަންތަކުގެ ޙާޟިރުގައި 72 ގަޑިއިރު ވަންދެން ކަލްޗަރ ކުރިއެވެ. އެގްޒޯޖެނަސް އެމްއެންއޭ ނެތް ހާލަތެއްގައި އެމްއެންއޭގެ ސެލްއުލަރ ކޮންޓެންޓް ފާހަގަ ނުކުރެވޭނެއެވެ ( ފޮޓޯ 3ޖީ ). ނަމަވެސް އެގްޒޯޖެނަސް އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން އެކްޓިވޭޓް ޓީ ސެލްތަކުން ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭ ގެ މިންވަރު ޑޯޒަށް ބަރޯސާވެގެން އިތުރުވެ، 6 އެމްއެމް އެމްއެންއޭ އާއި ހަމައަށް ފެނިފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 3ޖީ ). މި ނަތީޖާއިން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓްރާންސްޕޯޓަރ އެކްސްޕްރެޝަންގެ މިންވަރު ދަށްވެ، އިންޓްރާސެލިއުލަރ އެމްއެންއޭ މެޓަބޮލިޒަމް އަށް ޒިންމާވާ މައިގަނޑު އެންޒައިމް ނެތް ނަމަވެސް، ޓީއައިއެލް އިން އަދިވެސް އެމްއެންއޭ ނަގާފާނެއެވެ.
ބަލިމީހުންގެ ޓީ ސެލްތަކުގައި ހުންނަ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ސްޕެކްޓްރަމް އަދި އިން ވިޓްރޯ އެމްއެންއޭ އެބްސޯޕްޝަން އެކްސްޕެރިމެންޓްތަކުން ކެންސަރާއި ގުޅުންހުރި ފައިބްރޯބްލާސްޓްސް (ސީއޭއެފް) އިން އެމްއެންއޭ ނިކުތުމުގެ ފުރުސަތު އިތުރުވެ، ޓިއުމަރ ސެލްތަކުން ޓީއައިއެލްގެ ފީނޯޓައިޕް އަދި ފުންކްޝަން ރެގިއުލޭޓް ކުރެވިދާނެއެވެ. ޓީ ސެލްތަކަށް އެމްއެންއޭގެ އަސަރު ދެނެގަތުމަށްޓަކައި، އެމްއެންއޭ ހުރި ނުވަތަ ނެތް ހާލަތުގައި އިން ވިޓްރޯގައި ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތައް އެކްޓިވޭޓްކޮށް، އެ ސެލްތައް ގިނަވުމާއި ސައިޓޮކިން އުފެއްދުން ވަޒަންކޮށްފައިވެއެވެ. އެންމެ ގިނަ ޑޯޒްގައި އެމްއެންއޭ އިތުރުކުރުމަށްފަހު 7 ދުވަސް ފަހުން ޕޮޕިއުލޭޝަން ޑަބަލްވުމުގެ އަދަދު އާދައިގެ މިންވަރަކަށް ދަށްވިއިރު، ހުރިހާ ޑޯޒެއްގައި ވެސް ވައިގަރ ދަމަހައްޓާފައިވެއެވެ (ފޮޓޯ 4އޭ). މީގެ އިތުރުން އެގްޒޯޖެނަސް އެމްއެންއޭ އަށް ފަރުވާ ދިނުމުން ޓިއުމަރ ނެކްރޮސިސް ފެކްޓަރ-α (ޓީއެންއެފްα؛ ފޮޓޯ 4ބީ) އެކްސްޕްރެސްކުރާ ސީޑީ4 + އަދި ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތަކުގެ ނިސްބަތް އިތުރުވެއެވެ. މިއާ ޚިލާފަށް CD4 + T ސެލްތަކުގައި IFN-γ ގެ އިންޓްރާސެލިއުލަރ އުފެއްދުން ވަރަށް ބޮޑަށް ދަށްވި ނަމަވެސް CD8 + T ސެލްތަކުގައި ދަށްވެ، އިންޓަރލިއުކިން 2 އަށް މާބޮޑު ބަދަލެއް އައިސްފައެއް ނުވެއެވެ (IL-2؛ ފޮޓޯ 4، C އަދި D). އެހެންކަމުން މި އެމްއެންއޭ ޓްރީޓްކޮށްފައިވާ ޓީ ސެލް ކަލްޗަރތަކުން ސުޕަރނެޓެންޓްސްގެ އެންޒައިމް ލިންކްޑް އިމިއުނޯސޮރބަންޓް އެސޭ (ELISA) އިން ޓީއެންއެފްα މާބޮޑުތަނުން އިތުރުވެ، އައިއެފްއެން-γ ދަށްވެ، އައިއެލް-2 އަށް ބަދަލެއް ނާދެއެވެ (ފޮޓޯ 4، އީ އިން ޖީ). . އައިއެފްއެން-γ ދަށްވުމުން ދޭހަވަނީ ޓީ ސެލްތަކުގެ އެންޓި ޓިއުމަރ އެކްޓިވިޓީ ހުއްޓުވުމުގައި އެމްއެންއޭގެ ދައުރެއް އޮވެދާނެ ކަމަށެވެ. ޓީ ސެލް މެދުވެރިކޮށް ސައިޓޮޓޮކްސިސިޓީއަށް އެމްއެންއޭގެ އަސަރު ސިމިއުލޭޓް ކުރުމަށްޓަކައި، ގްރީން ފްލޫރެސްސެންޓް ޕްރޮޓީން (GFP) -CAR-T) ސެލްތަކުން ރެގިއުލޭޓް ކުރާ ފޯލޭޓް ރިސެޕްޓަރ α އަދި CAR-T (GFP) އަށް އަމާޒުކޮށްގެން ކިމެރިކް އެންޓިޖަން ރިސެޕްޓަރ ޓީ (FRα-CAR-T) ސެލްތައް އުފައްދަނީ ދުޅަހެޔޮ ޑޯނަރ ޕެރިފެރަލް ބްލަޑް މޮނޮނިއުކްލިއަރ ސެލްސް (PBMC) އިންނެވެ. ސީއޭއާރު-ޓީ ސެލްތައް އެމްއެންއޭގެ ޙާޟިރުގައި 24 ގަޑިއިރު ވަންދެން ކަލްޗަރކޮށް، އޭގެ ފަހުން ފޯލޭޓް ރިސެޕްޓަރ α އެކްސްޕްރެސްކުރާ އިންސާނާގެ އެސްކޭ-އޯވީ-3 އޯވަރިއަން ޓިއުމަރ ސެލްތަކާ އެކު އިފެކްޓަރ ޓު ޓާގެޓް ރޭޝިއޯ 10:1 ގައި ކޯ ކަލްޗަރ ކުރިއެވެ. އެމްއެންއޭ ފަރުވާ ދިނުމުން FRα-CAR-T ސެލްތަކުގެ މަރާލުމުގެ ހަރަކާތް ވަރަށް ބޮޑަށް ދަށްވެ، އެޑިނޯސިން އިން ފަރުވާ ދިން FRα-CAR-T ސެލްތަކާ އެއްގޮތެވެ ( ފޮޓޯ 4H ).
(އ) 7 ވަނަ ދުވަހު ސީދާ ކަލްޗަރ އިން ޖުމްލަ ވައިއޭބަލް ސެލް ކައުންޓާއި ޕޮޕިއުލޭޝަން ޑަބަލިންގ (ޕީޑީ) ބާ ގްރާފްގައި ދައްކުވައިދެނީ ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ހަ ޑޯނަރުންގެ މީން + އެސްއީއެމް އެވެ. މަދުވެގެން n = 3 މިނިވަން ތަޖުރިބާތަކުގެ ޑޭޓާ ތަމްސީލުކުރެއެވެ. (ބީ އިން ޑީ އަށް) ސީޑީ3/ސީޑީ28 އަދި އައިއެލް-2 ބޭނުންކޮށްގެން ޓީ ސެލްތައް އެމީހުންގެ އެމްއެންއޭ ކޮންސެންޓްރޭޝަންގައި 7 ދުވަސް ވަންދެން އެކްޓިވޭޓް ކުރިއެވެ. ތަޙުލީލު ކުރުމުގެ ކުރިން ސެލްތައް ސްޓިމިއުލޭޓް ކޮށްފައިވަނީ ގޯލްޖީސްޓޮޕް އާއި އެކު ޕީއެމްއޭ/އަޔޮނޮމައިސިން އިން 4 ގަޑިއިރު ވަންދެންނެވެ. ޓީ ސެލްތަކުގައި ޓީއެންއެފްα (ބީ) އެކްސްޕްރެޝަން. ދިރިހުރި ސެލްތަކުގައި TNFα އެކްސްޕްރެޝަންގެ މިސާލު ތަސްވީރު (ކަނާތް) އަދި ޓޭބަލް ޑޭޓާ (ވާތް) . ޓީ ސެލްތަކުގައި IFN-γ (C) އަދި IL-2 (D) އެކްސްޕްރެޝަން ވެއެވެ. ސައިޓޮކިންސްގެ އެކްސްޕްރެޝަން ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އިންނެވެ. ބާ ގްރާފް އިން ދައްކުވައިދެނީ މީން (n = 6 ޞިއްޙަތު ރަނގަޅު ޑޯނަރުން) + ސެމް އެވެ. ޕީ ވެލިއު ކަނޑައެޅުމަށްޓަކައި ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް އަދި ރިޕީޓެޑް މީސަރސް (*P<0.05 އަދި **P<0.01) ބޭނުންކުރުން. މަދުވެގެން n = 3 މިނިވަން ތަޖުރިބާތަކުގެ ޑޭޓާ ތަމްސީލުކުރެއެވެ. (E to G) CD3/CD28 އަދި IL-2 ބޭނުންކޮށްގެން ޓީ ސެލްތައް އެމީހުންގެ އެމްއެންއޭ ކޮންސެންޓްރޭޝަންގައި 7 ދުވަސް ވަންދެން އެކްޓިވޭޓް ކުރިއެވެ. މި މީޑިއަމް އެއްކޮށްފައިވަނީ ޕީއެމްއޭ/އަޔޮނޮމައިސިން ސްޓިމިއުލޭޝަންގެ 4 ގަޑިއިރުގެ ކުރިންނާއި ފަހުންނެވެ. ޓީއެންއެފްα (އީ)، އައިއެފްއެން-γ (އެފް) އަދި އައިއެލް-2 (ޖީ) ގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަންތައް ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ އެލިސާ އިންނެވެ. ބާ ގްރާފް އިން ދައްކުވައިދެނީ މީން (n = 5 ހެލްތީ ޑޯނަރުން) + ސެމް އެވެ. ޕީ ވެލިއު ކަނޑައެޅީ ވަން-ވޭ އެނަލިސިސް އޮފް ވެރިއަންސް އާއި ރިޕީޓެޑް މީސަރމަންޓްސް ބޭނުންކޮށްގެން (*P<0.05) އެވެ. ޑޮޓް ލައިން އިން ދައްކުވައިދެނީ ޑިޓެކްޝަންގެ ޑިޓެކްޝަން ލިމިޓެވެ. (ހ) ސެލް ލައިސިސް އެސޭ. FRα-CAR-T ނުވަތަ GFP-CAR-T ސެލްތައް އެޑިނޯސިން (250μM) ނުވަތަ MNA (10 mM) އިން 24 ގަޑިއިރު ވަންދެން އެޖެސްޓްކޮށް، ނުވަތަ ފަރުވާ ނުދީ ދޫކޮށްލާފައި (Ctrl) ބެހެއްޓިއެވެ. އެސްކޭ-އޯވީ-3 ސެލްތަކުގެ އިންސައްތަ މަރާލުމުގެ މިންވަރު ބެލިއެވެ. ޕީ ވެލިއު ކަނޑައެޅެނީ ވެލްޗް ޓީ ޓެސްޓުން (*P<0.5 އަދި **P<0.01) އެވެ.
އެމްއެންއޭ އަށް ޑިޕެންޑް ޓީއެންއެފްα އެކްސްޕްރެޝަން ރެގިއުލޭޝަންގެ މެކޭނިސްޓިކް ވިސްނުމެއް ހޯދުމަށްޓަކައި އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ޓީ ސެލްތަކުގެ ޓީއެންއެފްα އެމްއާރްއެންއޭ އަށް އަންނަ ބަދަލުތައް ވަޒަންކޮށްފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 5އޭ ). އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ދުޅަހެޔޮ ޑޯނަރ ޓީ ސެލްތަކުން ޓީއެންއެފްα ޓްރާންސްކްރިޕްޝަން ލެވެލް ދެގުނަ އިތުރުވެފައިވާއިރު، މިއީ އެމްއެންއޭ ޑިޕެންޑް ވެފައިވަނީ ޓީއެންއެފްα ޓްރާންސްކްރިޕްޝަނަލް ރެގިއުލޭޝަނަށް ކަމަށް ދައްކައެވެ. މި ވެދާނެ ރެގިއުލޭޓަރީ މެކޭނިޒަމް ތަހުގީގު ކުރުމަށްޓަކައި، ޓީއެންއެފްα ރެގިއުލޭޓްކުރާ އެނގޭ ދެ ޓްރާންސްކްރިޕްޝަން ފެކްޓަރސް ކަމަށްވާ އެކްޓިވޭޓެޑް ޓީ ސެލް ނިއުކްލިއަރ ފެކްޓަރ (NFAT) އަދި ސްޕެސިފިކް ޕްރޮޓީން 1 (Sp1) ޕްރޮކްސިމަލް ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ އަށް އެމްއެންއޭ ބައިންޑް ވުމުން އިވެލުއޭޓް ކުރެވުނެވެ ( 30 ). ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ ގައި 6 ފާހަގަކުރެވިފައިވާ އެންއެފްއޭޓީ ބައިންޑިންގ ސައިޓް އަދި 2 އެސްޕީ1 ބައިންޑިންގ ސައިޓް ހިމެނޭއިރު، އެއް ސައިޓެއްގައި [5’ކެޕް އިން -55 ބޭސް ޕެއަރސް (bp)] (30) އެއްކޮށް ޖެހިފައިވެއެވެ. ކްރޮމެޓިން އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން (ChIP) އިން ދައްކާ ގޮތުގައި އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިނުމުން އެސްޕީ1 އާއި ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ އާއި ގުޅުން ތިންގުނަ އިތުރުވެއެވެ. އެންއެފްއޭޓީ ހިމެނުން ވެސް އިތުރުވެ، މުހިންމުކަމާ ގާތްވެގެން ދިޔައެވެ (ފޮޓޯ 5ބީ). މި ޑޭޓާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އެމްއެންއޭ އިން Sp1 ޓްރާންސްކްރިޕްޝަން މެދުވެރިކޮށް TNFα ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ރެގިއުލޭޓް ކުރާއިރު، އަދި ކުޑަ މިންވަރަކަށް NFAT ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ރެގިއުލޭޓް ކުރެއެވެ.
(އ) އެމްއެންއޭ ނުހިމެނޭ ގޮތަށް ކަލްޗަރ ކުރެވިފައިވާ ޓީ ސެލްތަކާ އަޅާބަލާއިރު، އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ޓީ ސެލްތަކުގައި ޓީއެންއެފްα އެކްސްޕްރެޝަންގެ ފޯލްޑް ބަދަލުވެއެވެ. ސެމް އާއި އެކު އެކްސްޕްރެޝަން ޕެޓަރން ދައްކާފައިވަނީ (n = 5 ހެލްތީ ޑޯނަރސް) އެވެ. މަދުވެގެން n = 3 މިނިވަން ތަޖުރިބާތަކުގެ ޑޭޓާ ތަމްސީލުކުރެއެވެ. (ބ) އެންއެފްއޭޓީ އަދި އެސްޕީ1 އަށްފަހު 8 އެމްއެމް އެމްއެންއޭ އިން ނުވަތަ ނުލައި ފަރުވާ ދިން ޓީ ސެލްތަކުގެ ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ (ސީޓީއާރުއެލް) އާއި ޕީއެމްއޭ/އަޔޮނޮމައިސިން ސްޓިމިއުލޭޝަން އާއި ގުޅިގެން 4 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓިއެވެ. އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން އަށް ނެގެޓިވް އަދި ޕޮޒިޓިވް ކޮންޓްރޯލްގެ ގޮތުގައި ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ އިމިއުނޯގްލޮބިއުލިން ޖީ (އައިޖީޖީ) އަދި އެޗް3 އެވެ. ޗިޕްގެ ކުއަންޓިފިކޭޝަން އިން ދައްކާ ގޮތުގައި އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ސެލްތަކުގައި ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ އަށް Sp1 އަދި NFAT ބައިންޑްވުން ކޮންޓްރޯލް އާއި އަޅާބަލާއިރު އެތައް ގުނައެއް އިތުރުވެއެވެ. މަދުވެގެން n = 3 މިނިވަން ތަޖުރިބާތަކުގެ ޑޭޓާ ތަމްސީލުކުރެއެވެ. ގިނަ ޓީ ޓެސްޓްތަކުން ކަނޑައެޅިފައިވާ ޕީ ވެލިއު (*** P <0.01) އެވެ. (ސ) އެޗްޖީއެސްސީގެ އެސައިޓްސް އާއި އަޅާބަލާއިރު ޓީ ސެލްތަކުން (ނޮން-ސައިޓޮޓޮކްސިކް) ޓިއުމަރުގައި ޓީއެންއެފް އެކްސްޕްރެޝަން އިތުރުވެފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވުނެވެ. އެ ކުލަތަކުން ތަމްސީލުކުރަނީ އެކި ބަލިމީހުންނެވެ. ދައްކާފައިވާ ސެލްތައް ރެންޑަމްކޮށް 300 އަށް ސާމްޕަލްކޮށް، އޯވަރޑްރޯވުން ލިމިޓް ކުރުމަށްޓަކައި ޖިޓަރ ކޮށްފައިވެއެވެ (** Padj = 0.0076). (ޑ) އޯވަރީ ކެންސަރަށް އެމްއެންއޭގެ ހުށަހަޅާފައިވާ މޮޑެލް. އެމްއެންއޭ އުފެދެނީ ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގައި އަދި ޓީއެމްއީގައި ހުންނަ ފައިބްރޯބްލާސްޓްތަކުގައި ކަމަށާއި ޓީ ސެލްތަކުން ނަގައެވެ. އެމްއެންއޭ އިން ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ އާއި އެސްޕީ1 ބައިންޑްވުން އިތުރުވެ، ޓީއެންއެފްα ޓްރާންސްކްރިޕްޝަން އިތުރުވެ، ޓީއެންއެފްα ސައިޓޮކިން އުފެއްދުން އިތުރުވެއެވެ. އަދި އެމްއެންއޭ ގެ ސަބަބުން އައިއެފްއެން-γ ދަށްވެއެވެ. ޓީ ސެލްގެ މަސައްކަތް ހުއްޓުވުމުން މަރާލުމުގެ ޤާބިލުކަން ދަށްވެ، ޓިއުމަރު ބޮޑުވުން އަވަސްވެއެވެ.
ރިޕޯޓްތައް ބުނާ ގޮތުގައި ޓީއެންއެފްα ގެ ކުރިމައްޗާއި ފަހަތަށް ޑިޕެންޑް އެންޓި ޓިއުމަރ އަދި އެންޓި ޓިއުމަރ އިފެކްޓްސް ހުރި ނަމަވެސް އޯވަރީ ކެންސަރު ބޮޑުވުމާއި މެޓާސްޓޭސިސް ކުރިއެރުވުމުގައި މިއީ ގިނަ ބަޔަކަށް އެނގޭ ދައުރެއް އަދާކުރާ އެއްޗެކެވެ ( 31-33 ). ރިޕޯޓްތައް ބުނާގޮތުން އޯވަރީ ކެންސަރު ޖެހިފައިވާ ބަލިމީހުންގެ އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރ ޓިޝޫތަކުގައި ޓީއެންއެފްα ގެ މިންވަރު ބެނިން ޓިޝޫތަކުގައި ހުންނަ މިންވަރަށްވުރެ މަތިވެއެވެ ( 34-36 ). މެކޭނިޒަމްގެ ގޮތުން ބަލާއިރު، ޓީއެންއެފްα އިން ލޭގެ ހުދު ސެލްތައް އެކްޓިވޭޓްވުމާއި، ފުންކްޝަން އަދި ޕްރޮލިފަރޭޝަން ރެގިއުލޭޓްކޮށް، ކެންސަރު ސެލްތަކުގެ ފީނޯޓައިޕް ބަދަލުކޮށްދެއެވެ (37، 38). މި ހޯދުންތަކާ އެއްގޮތަށް ޑިފެރެންޝަލް ޖީން އެކްސްޕްރެޝަން އެނަލިސިސް އިން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓިއުމަރ ޓިޝޫތަކުގައި ހުންނަ ޓީ ސެލްތަކުގައި އެސައިޓްސް އާއި އަޅާބަލާއިރު ޓީއެންއެފް ވަރަށް ބޮޑަށް އަޕް ރެގިއުލޭޓް ވެފައިވެއެވެ ( ފޮޓޯ 5ސީ ). ޓީއެންއެފް އެކްސްޕްރެޝަން އިތުރުވުން ފެނިފައިވަނީ ހަމައެކަނި ނޮން ސައިޓޮޓޮކްސިކް ފީނޯޓައިޕް އެއް ހުންނަ ޓީ ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކުންނެވެ ( ފޮޓޯ S5A ). ޚުލާޞާކޮށް ދަންނަވާނަމަ، މި ޑޭޓާތަކުން އެމްއެންއޭ އިން އެޗްޖީއެސްސީގައި ޑައުއަލް އިމިއުނޯ ސަޕްރެސިވް އަދި ޓިއުމަރ ޕްރޮމޯޓިންގ އިފެކްޓްސް ހުރި ކަމަށް ބުނާ ވިސްނުމަށް ތާއީދު ލިބެއެވެ.
ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީގެ މައްޗަށް ބިނާކޮށް ފްލޫރެސްސެންޓް ލޭބަލިންގ ހެދުމަކީ ޓީއައިއެލް މެޓަބޮލިޒަމް ދިރާސާކުރުމުގެ މައިގަނޑު ގޮތަކަށެވެ. މި ދިރާސާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ސެކަންޑަރީ ލިމްފޮއިޑް ގުނަވަންތަކުން ލިބޭ ޕެރިފެރަލް ބްލަޑް ލިމްފޯސައިޓް ނުވަތަ ޓީ ސެލްތަކާ އަޅާބަލާއިރު މައުރިން އަދި ހިއުމަން ޓީއައިއެލް ގައި ގްލޫކޯޒް ނެގުމުގެ ފުރުސަތު ބޮޑުވެ (4، 39) މައިޓޮކޮންޑްރިއަލްގެ މަސައްކަތް މަޑުމަޑުން ގެއްލިގެންދެއެވެ (19، 40). މި ދިރާސާގައި އަޅުގަނޑުމެންނަށް މިފަދަ ނަތީޖާތަކެއް ފެނިފައިވީނަމަވެސް، މުހިއްމު ތަރައްޤީއަކީ އެއް ރިސެކްޓް ކުރެވިފައިވާ ޓިއުމަރ ޓިޝޫއަކުން ޓިއުމަރ ސެލްތަކާއި ޓީއައިއެލްގެ މެޓަބޮލިޒަމް އަޅާކިޔުމެވެ. މި ކުރީގެ ބައެއް ރިޕޯޓްތަކާ އެއްގޮތަށް، އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރުން ލިބޭ ޓިއުމަރ (CD45-EpCAM +) ސެލްތަކުގައި ސީޑީ8 + އަދި ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކަށްވުރެ ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރު މަތިވުމުން، ޓިއުމަރ ސެލްތަކުން ގްލޫކޯޒް ނަގާ މިންވަރު މަތިވުމަކީ ޓީ ސެލްތަކާ އަޅާކިޔޭނެ ކަމެއް ކަމަށް ބެލެވެއެވެ. ޓީ ސެލް ވާދަވެރިކަމުގެ ކޮންސެޕްޓެވެ. ޓީއެމްއީ އެވެ. ނަމަވެސް ޓިއުމަރ ސެލްތަކުގެ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތަކަށްވުރެ މަތި ނަމަވެސް މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކާ އެއްގޮތެވެ. މި ނަތީޖާތަކުން ޓިއުމަރ ސެލްތަކަށް އޮކްސިޑޭޓިވް މެޓަބޮލިޒަމް މުހިންމު ކަމަށް އުފެދިފައިވާ ތީމް ވަރުގަދަވެގެންދެއެވެ ( 41 , 42 ). އަދި ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކަށްވުރެ ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތައް އޮކްސިޑޭޓިވް ޑިސްފެންޝަން އަށް ފަސޭހަވެދާނެ ކަމަށް ނުވަތަ ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކުން މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ ދެމެހެއްޓުމަށް ގްލޫކޯޒް ނޫން އެހެން ކާބަން ސޯސްތައް ބޭނުންކުރެވިދާނެ ކަމަށް ވެސް އެމީހުން ލަފާކުރެއެވެ ( 43 , 44 ). ފާހަގަކޮށްލަންޖެހޭ ކަމަކީ އެސިޓިސްގައި ސީޑީ4 + ޓީ އިފެކްޓަރސް، ޓީ އިފެކްޓަރ މެމޮރީ އަދި ޓީ ސެންޓްރަލް މެމޮރީ ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް ނުވަތަ މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީގައި ތަފާތެއް އަޅުގަނޑުމެންނަށް ނުފެނުނުކަމެވެ. ހަމައެފަދައިން ޓިއުމަރުތަކުގައި ހުންނަ ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތަކުގެ ޑިފެރެންޝިއޭޝަން ސްޓޭޓާއި ގްލޫކޯޒް ނެގުމަށް އަންނަ ބަދަލުތަކާ ގުޅުމެއް ނެތް ކަމަށާއި، މިއީ އިން ވިޓްރޯގައި ކަލްޗަރ ކުރެވިފައިވާ ޓީ ސެލްތަކާއި އިން ވިވޯގައި އިންސާނާގެ ޓީއައިއެލް އާއި ދެމެދު އޮންނަ ބޮޑު ތަފާތެއް ހާމަކޮށްދޭ ކަމެކެވެ ( 22 ). މި ތަޙުލީލުތައް ކަށަވަރުކޮށްދިނީ އަންބަޔަސްޑް އޮޓޮމެޓިކް ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަން އެލޮކޭޝަން ބޭނުންކޮށްގެން ވެސް ކަމަށާއި، މިކަމުން އިތުރަށް ހާމަވެގެން ދިޔައީ ޓިއުމަރ ސެލްތަކަށްވުރެ ގްލޫކޯޒް އަޕްޓޭކް އަދި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީ މަތި CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ސެލްތައް އާންމު ނަމަވެސް މެޓަބޮލިކް އެކްޓިވް ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަން ހުންނަ ކަމަށެވެ. މި ޕޮޕިއުލޭޝަން ތަމްސީލުކުރަނީ scRNA-seq އެނަލިސިސްގައި ފާހަގަކުރެވުނު މައިލޯއިޑް ސަޕްރެސަރ ސެލް ނުވަތަ ޕްލާސްމާސައިޓޮއިޑް ޑެންޑްރިޓިކް ސެލްސްގެ ޕިއުޓޭޓިވް ސަބްޕޮޕިއުލޭޝަން ކަމަށް ވެދާނެއެވެ. މިދެކަންތައްވެސް އިންސާނާގެ އޯވަރީ ޓިއުމަރުތަކުގައި ރިޕޯޓްކުރެވިފައިވީނަމަވެސް [45]، އަދިވެސް ބޭނުންވަނީ އިތުރު މަސައްކަތަކީ މި މައިލޯއިޑް ސަބްޕޮޕިއުލޭޝަން ބަޔާންކުރުމެވެ.
ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީއަށް ބިނާކޮށް ސެލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައި ގްލޫކޯޒް އަދި އޮކްސިޑޭޓިވް މެޓަބޮލިޒަމްގެ އާންމު ތަފާތުތައް ސާފުކުރެވުނު ނަމަވެސް، ޓީއެމްއީގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް މެޓަބޮލިޒަމްއަށް ގްލޫކޯޒް ނުވަތަ އެހެން ކާބަން ސޯސްތަކުން އުފައްދާ ސީދާ މެޓަބޮލައިޓްތައް އަދި ކަނޑައެޅިފައެއް ނުވެއެވެ. ދީފައިވާ ޓީއައިއެލް ސަބްސެޓަކަށް މެޓަބޮލައިޓްތައް ހުރުން ނުވަތަ ނެތްކަން ޙަވާލުކުރުމަށްޓަކައި، ނަގާފައިވާ ޓިޝޫއިން ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަން ސާފުކުރަން ޖެހެއެވެ. އެހެންކަމުން އަޅުގަނޑުމެންގެ ސެލް އެންރިޗްމަންޓް މެތެޑަކީ މާސް ސްޕެކްޓްރޮމެޓްރީއާ ގުޅިގެން މެޗިންގ ޕޭޝަންޓް ސާމްޕަލްތަކުގައި ޓީ ސެލްތަކާއި ޓިއުމަރ ސެލް ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކުގައި ތަފާތު ގޮތަކަށް މުއްސަނދިވެފައިވާ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ވިސްނުން ލިބިގެންދާނެ ކަމެކެވެ. މި އުސޫލުން ފްލޫރެސެންސް އެކްޓިވޭޓް ސެލް ސޯރޓިންގ އަށް ވުރެ ފައިދާތަކެއް ހުރި ނަމަވެސް، ވަކި މެޓަބޮލައިޓް ލައިބްރަރީތަކަށް އިންހެރެންޓް ސްޓެބިލިޓީ އަދި/ނުވަތަ ހަލުވި ޓާރނަވަރ ރޭޓްގެ ސަބަބުން އަސަރު ކޮށްފާނެއެވެ (22). އެހެންނަމަވެސް، އަޅުގަނޑުމެންގެ އުސޫލުން ދެނެގަނެވޭ ދެ އިމިއުނޯ ސަޕްރެސިވް މެޓަބޮލައިޓް ކަމަށްވާ އެޑިނޯސިން އަދި ކިނޫރެނިން ދެނެގަނެވުނީ، އެއީ ސާމްޕަލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައި ވަރަށް ބޮޑަށް ތަފާތުވާތީއެވެ.
އަޅުގަނޑުމެން ޓިއުމަރުތަކާއި ޓީއައިއެލް ސަބްޓައިޕްތަކުގެ މެޓަބޮނޮމިކް އެނަލިސިސް އިން އޯވަރީ ޓީއެމްއީގައި މެޓަބޮލައިޓްސްގެ ދައުރާ ބެހޭ އިތުރު ވިސްނުންތަކެއް ލިބިގެންދެއެވެ. ފުރަތަމަ ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ ބޭނުންކޮށްގެން އަޅުގަނޑުމެން ކަނޑައެޅީ ޓިއުމަރުތަކާއި ސީޑީ4 + ޓީ ސެލްތަކުގެ މެދުގައި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީގައި ތަފާތެއް ނެތް ކަމަށެވެ. ނަމަވެސް އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް ތަޙުލީލުތަކުން މި އާބާދީތަކުގެ ތެރޭގައި މެޓަބޮލައިޓްސްގެ ގިނަކަމަށް ބޮޑެތި ބަދަލުތަކެއް އައިސްފައިވާކަން ފާހަގަކުރެވިފައިވާއިރު، މިކަމުން ދައްކާގޮތުގައި ޓީއައިއެލް މެޓަބޮލިޒަމްއާއި އޭގެ ޖުމްލަ މެޓަބޮލިކް އެކްޓިވިޓީއާ ބެހޭ ނިންމުންތައް ފަރުވާތެރިކަމާއެކު މާނަކުރަންޖެހެއެވެ. ދެވަނަ ކަމަކަށް އެމްއެންއޭ އަކީ ޓިއުމަރުތަކުގައި ނޫން ނަމަވެސް އެސިޓިސްގައި ސީޑީ45-ސެލްތަކާއި ޓީ ސެލްތަކުގެ މެދުގައި އެންމެ ބޮޑު ތަފާތެއް ހުންނަ މެޓަބޮލައިޓެވެ. އެހެންކަމުން ކޮމްޕާރޓްމަންޓަލައިޒޭޝަން އާއި ޓިއުމަރ ލޮކޭޝަން އިން ޓީއައިއެލް މެޓަބޮލިޒަމް އަށް ތަފާތު އަސަރުތަކެއް ކޮށްފާނެ ކަމަށާއި، މިއީ ދީފައިވާ މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓެއްގައި ދިމާވެދާނެ ހެޓަރޮޖެނިޓީ އަށް އަލިއަޅުވާލާ ކަމެކެވެ. ތިންވަނަ ކަމަކީ، އެމްއެންއޭ އުފައްދާ އެންޒައިމް އެންއެންއެމްޓީގެ އެކްސްޕްރެޝަން މައިގަނޑު ގޮތެއްގައި ސީއޭއެފް އަށް ނިސްބަތްވާއިރު، މިއީ މަދު މިންވަރަކަށް ޓިއުމަރ ސެލްތަކެއް ނަމަވެސް، ޓިއުމަރ އިން އުފައްދާ ޓީ ސެލްތަކުގައި ފާހަގަކުރެވޭ އެމްއެންއޭ ލެވެލްތައް ފެނެއެވެ. އޯވަރީ ސީއޭއެފްގައި އެންއެންއެމްޓީ އޯވަރ އެކްސްޕްރެޝަން ވުމަކީ ކެންސަރު ކުރިއެރުވުމަށް ކުރާ އަސަރެއްކަން އެނގޭ ކަމަކަށް ވާއިރު، އޭގެ ސަބަބަކީ ބައެއް ގޮތްގޮތުން ސީއޭއެފް މެޓަބޮލިޒަމް ޕްރޮމޯޓްވުމާއި، ޓިއުމަރ އިންވޭޝަން އަދި މެޓާސްޓޭސިސް އެވެ ( 27 ). ޓީއައިއެލްގެ ޖުމްލަ މިންވަރު މެދުމިނުގައި ހުރި ނަމަވެސް، ސީއޭއެފްގައި އެންއެންއެމްޓީ އެކްސްޕްރެޝަން ވުމަކީ ކެންސަރ ޖީނޯމް އެޓްލާސް (ޓީސީޖީއޭ) މެސެންޗައިމަލް ސަބްޓައިޕް އާއި ވަރަށް ގާތުން ގުޅިފައިވާ ކަމެއް ކަމަށާއި، މިއީ ޕްރޮގްނޯސިސް ދަށްވުމާ ގުޅުންހުރި ކަމެއް ކަމަށް ވެސް ޑރ. އެންމެ ފަހުން އެމްއެންއޭ ޑިގްރެޑޭޝަން އަށް ޒިންމާވާ އެންޒައިމް އޭއޯއެކްސް1 ގެ އެކްސްޕްރެޝަން ވެސް ސީއޭއެފް ޕޮޕިއުލޭޝަން އަށް ލިމިޓް ކުރެވިފައިވާއިރު، މިއީ ޓީ ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭ މެޓަބޮލައިޒް ކުރުމުގެ ޤާބިލުކަން ނެތްކަން ދޭހަވާ ކަމެކެވެ. މި ނަތީޖާތަކުން މި ހޯދުން ޔަގީންކުރުމަށް އިތުރު މަސައްކަތްތަކެއް ކުރަންޖެހުނު ނަމަވެސް، ޓީ ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭގެ މިންވަރު މަތިވުމަކީ އިމިއުނޯ ސަޕްރެސިވް ސީއޭއެފް މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓެއް ހުރިކަން ދައްކުވައިދޭ ޚިޔާލަށް ތާއީދުކުރާ ނަތީޖާތަކެކެވެ.
އެމްއެންއޭ ޓްރާންސްޕޯޓަރސްގެ އެކްސްޕްރެޝަން ލެވެލް ދަށްވުމާއި އެމްއެންއޭ މެޓަބޮލިޒަމްގައި ބައިވެރިވާ މުހިއްމު ޕްރޮޓީންތަކުގެ ފާހަގަ ނުކުރެވޭ މިންވަރަށް ބަލާއިރު، ޓީ ސެލްތަކުގައި އެމްއެންއޭ ހުރުމަކީ ހީވެސް ނުކުރާ ކަމެކެވެ. މިނިވަން ދެ ކޮހޯޓެއްގެ scRNA-seq އެނަލިސިސް އާއި ޓާގެޓްޑް qPCR އިން NNMT އަދި AOX1 ވެސް ހޯދިފައެއް ނުވެއެވެ. މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި އެމްއެންއޭ އަކީ ޓީ ސެލްތަކުން އުފައްދާ އެއްޗެއް ނޫން ކަމަށާއި، އެއީ ވަށައިގެންވާ ޓީއެމްއީ އިން ޖަހައިގަންނަ އެއްޗެއް ކަމަށެވެ. އިން ވިޓްރޯ ތަޖުރިބާތަކުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓީ ސެލްތަކުގައި އެގްޒޯޖެނަސް އެމްއެންއޭ ޖަމާވާން ފަށައެވެ.
އަޅުގަނޑުމެންގެ އިން ވިޓްރޯ ދިރާސާތަކުން ދައްކާފައިވާ ގޮތުގައި އެގްޒޯޖެނަސް އެމްއެންއޭ އިން ޓީ ސެލްތަކުގައި ޓީއެންއެފްα ގެ އެކްސްޕްރެޝަން އިންޑައުސްކޮށް، ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ އާއި އެސްޕީ1 ބައިންޑްވުން އިތުރުކޮށްދެއެވެ. ޓީއެންއެފްα ގައި އެންޓި-ޓިއުމަރ އަދި އެންޓި-ޓިއުމަރ ފަންކްޝަންތައް ހުރި ނަމަވެސް، އޯވަރީ ކެންސަރުގައި ޓީއެންއެފްα އިން އޯވަރީ ކެންސަރު ބޮޑުވުމަށް މަގުފަހިކޮށްދެއެވެ (31-33). އޯވަރީ ޓިއުމަރ ސެލް ކަލްޗަރގައި ޓީއެންއެފްα ނިއުޓްރަލައިޒޭޝަން ނުވަތަ މައުސް މޮޑެލްތަކުގައި ޓީއެންއެފްα ސިގްނަލް ނައްތާލުމަކީ ޓީއެންއެފްα މެދުވެރިކޮށް އިންފްލެމެޓަރީ ސައިޓޮކިން އުފެއްދުން ރަނގަޅުކޮށްދީ ޓިއުމަރު ބޮޑުވުން ހުއްޓުވޭނެ ކަމެކެވެ ( 32 , 35 ). އެހެންކަމުން މި ހާލަތުގައި ޓީއެމްއީ އިން އުފެދިފައިވާ އެމްއެންއޭ އަކީ އޮޓޯކްރައިން ލޫޕް މެދުވެރިކޮށް ޓީއެންއެފްα އަށް ޑިޕެންޑް މެކޭނިޒަމެއް މެދުވެރިކޮށް ޕްރޯ-އިންފްލެމެޓަރީ މެޓަބޮލައިޓް އެއްގެ ގޮތުގައި މަސައްކަތްކޮށް، އޯވަރީ ކެންސަރު އުފެދުމާއި ފެތުރުން ކުރިއެރުވުމަށް މަގުފަހިކޮށްދޭ އެއްޗެކެވެ ( 31 ). މި ފުރުޞަތުގެ މައްޗަށް ބިނާކޮށް، އޯވަރީ ކެންސަރަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ބޭނުންކުރެވޭ އެއްޗެއްގެ ގޮތުގައި ޓީއެންއެފްα ބްލޮކޭޑް ދިރާސާ ކުރަމުންދެއެވެ (37، 48، 49). މީގެ އިތުރުން އެމްއެންއޭ އިން އޯވަރިއަން ޓިއުމަރ ސެލްތަކަށް ސީއޭއާރް-ޓީ ސެލްތަކުގެ ސައިޓޮޓޮކްސިސިޓީ ދަށްކޮށްދީ، އެމްއެންއޭ މެދުވެރިކޮށް ދިފާޢީ ނިޒާމު ދަމަހައްޓާ ކަމުގެ އިތުރު ހެކިތައް ލިބިގެންދެއެވެ. ޖަމާޢަތުގައި ބަލާއިރު މި ނަތީޖާތަކުން ދައްކާގޮތުގައި ޓިއުމަރާއި ސީއޭއެފް ސެލްތަކުން އެމްއެންއޭ އެކްސްޓްރާސެލިއުލަރ ޓީއެމްއީ އަށް ސެކްރެޓް ކުރާ މޮޑެލްއެކެވެ. (i) ޓީއެންއެފް އިންޑައުސްޑް އޯވަރީ ކެންސަރ ގްރޯތް ސްޓިމިއުލޭޝަން އަދި (ii) އެމްއެންއޭ އިންޑައުސްޑް ޓީ ސެލް ސައިޓޮޓޮކްސިކް އެކްޓިވިޓީ އިންހިބިޝަން މެދުވެރިކޮށް މިއީ ޑައުއަލް ޓިއުމަރ އެފެކްޓެއް ލިބިދާނެ ކަމެކެވެ ( ފޮޓޯ 5ޑީ ).
ނިންމާލަމުން ދަންނަވާނަމަ، ރެޕިޑް ސެލް އެންރިޗްމަންޓާއި، ސިންގަލް ސެލް ސިކުއެންސިންގ އަދި މެޓަބޮލިކް ޕްރޮފައިލިންގ އެއްކޮށްގެން މި ދިރާސާއިން އެޗްޖީއެސްސީ ބަލިމީހުންގެ ޓިއުމަރާއި އެސިޓިސް ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ހުންނަ އިމިއުނޯމެޓަބޮލޮމިކް ތަފާތުތައް ހާމަވެފައިވެއެވެ. މި ފުރިހަމަ ތަޙުލީލުން ދައްކާ ގޮތުގައި ޓީ ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ގްލޫކޯޒް ނެގުމާއި މައިޓޮކޮންޑްރިއަލް އެކްޓިވިޓީގައި ތަފާތުތަކެއް ހުރި ކަމަށާއި، އެމްއެންއޭ އަކީ ނޮން ސެލް އޮޓޮނޮމަސް އިމިއުން ރެގިއުލޭޓަރީ މެޓަބޮލައިޓް އެއްގެ ގޮތުގައި ދެނެގަނެވިފައިވާ ކަމަށެވެ. މި ޑޭޓާތަކުގެ އަސަރު އިންސާނާގެ ކެންސަރުތަކުގައި ޓީ ސެލް މެޓަބޮލިޒަމް އަށް ޓީއެމްއީ އިން އަސަރުކުރާ ގޮތަށެވެ. ޓީ ސެލްތަކާއި ކެންސަރު ސެލްތަކުގެ މެދުގައި ނިއުޓްރިއެންޓްސް ހޯދުމަށް ސީދާ ވާދަވެރިކަން ރިޕޯޓްކޮށްފައިވީނަމަވެސް، މެޓަބޮލައިޓްސް އިން ޓިއުމަރ ޕްރޮގްރެޝަން ޕްރޮމޯޓްކޮށް، އެންޑޯޖެނަސް އިމިއުން ރިސްޕޮންސްތައް ދަމަހައްޓަން ނުސީދާ ރެގިއުލޭޓަރެއްގެ ގޮތުގައި ވެސް މަސައްކަތް ކުރެވިދާނެއެވެ. މި ރެގިއުލޭޓަރީ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ފަންކްޝަނަލް ރޯލް އިތުރަށް ބަޔާންކުރުމުން އެންޓި-ޓިއުމަރ އިމިއުން ރިސްޕޮންސް އިތުރުކުރުމަށް ބަދަލު ސްޓްރެޓެޖީތަކެއް ހުޅުވިދާނެއެވެ.
ބަލިމީހުންގެ ސްޕީސިމަންސް އާއި ކްލިނިކަލް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވަނީ ކެނެޑާގެ ޓިޝޫ ރިޕޮޒިޓަރީ ނެޓްވޯކުން ސެޓްފިކެޓް ލިބިފައިވާ ބީސީ ކެންސަރު ޓިއުމަރ ޓިޝޫ ރިޕޮޒިޓަރީ މެދުވެރިކޮށެވެ. ބީސީ ކެންސަރު ރިސާޗް އެތިކްސް ކޮމިޓީ އާއި ޔުނިވާސިޓީ އޮފް ބްރިޓިޝް ކޮލަމްބިއާ (H07-00463) އިން ފާސްކުރި ޕްރޮޓޮކޯލްގައިވާ ގޮތުން ހުރިހާ ބަލިމީހުންގެ ސާމްޕަލްތަކާއި ކްލިނިކަލް ޑޭޓާ ހޯދާފައިވާ ލިޔުމުން ރުހުން ނުވަތަ ރަސްމީކޮށް ރުހުން ދޫކޮށްލި އެވެ. މި ސާމްޕަލްތައް ރައްކާކޮށްފައިވަނީ ސެޓްފިކެޓް ލިބިފައިވާ ބަޔޯބެންކް (BRC-00290) ގައެވެ. ބަލިމީހުންގެ ތަފްސީލީ ސިފަތައް ތާވަލް S1 އަދި S5 ގައި އެވަނީއެވެ. ކްރައިއޯޕްރިޒަރވޭޝަން އަށް ސްކަލްޕެލް ބޭނުންކޮށްގެން ބަލިމީހާގެ ޓިއުމަރ ސާމްޕަލް މެކޭނިކަލީ ޑިކޮމްޕޯސްކޮށް، އޭގެ ފަހުން 100 މައިކްރޯންގެ ފިލްޓަރެއްގެ ތެރެއިން ކޮއްޕާލުމުން އެއް ސެލް ސަސްޕެންޝަނެއް ލިބެއެވެ. ބަލިމީހާގެ އެސައިޓްސް 1500 rpm ގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖްކޮށްގެން ސެލްތައް ޕެލެޓްކޮށް ސުޕަރނެޓެންޓް ނައްތާލިއެވެ. ޓިއުމަރާއި އެސައިޓްސް އިން ލިބުނު ސެލްތައް %50 ހީޓް އިންއެކްޓިވޭޓްޑް ހިއުމަން އޭބީ ސީރަމް (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް)، %40 އާރްޕީއެމްއައި-1640 (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އަދި %10 ޑައިމެތައިލް ސަލްފޮކްސައިޑްގައި ކްރައިއޯޕްރިޒަރވް ކޮށްފައިވެއެވެ. މި ރައްކާކުރެވިފައިވާ ސިންގަލް ސެލް ސަސްޕެންޝަންތައް ތެޔޮކޮށް، ތިރީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ މެޓަބޮލޮމިކްސް އަދި މެޓަބޮލައިޓް ކަނޑައެޅުމަށް ބޭނުންކުރިއެވެ.
ފުރިހަމަ މީޑިއަމް އެކުލެވިގެންވަނީ 0.22 μm ފިލްޓަރޑް 50:50 ސަޕްލިމެންޓް ކޮށްފައިވާ RPMI 1640: AimV އިންނެވެ. އާރްޕީއެމްއައި 1640 + 2.05 އެމްއެމް އެލް-ގްލޫޓާމިން (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ސަޕްލިމެންޓްކޮށްފައިވަނީ %10 ހީޓް އިންއެކްޓިވޭޓްޑް ހިއުމަން އޭބީ ސީރަމް (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް)، 12.5 އެމްއެމް ހެޕެސް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް)، 2 އެމްއެމް އެލް-ގްލޫޓާމިން (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް)، 1 x ޕެނިސިލިން ސްޓްރެޕްޓޮމައިސިން (ޕެންސްޓްރެޕް) ސޮލިއުޝަން (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އަދި 50 μMB-މަރކެޕްޓޯއީތަނަލް އެވެ. އެއިމްވީ (އިންވިޓްރޯޖެން) އަށް 20 އެމްއެމް ހެޕެސް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) އަދި 2 އެމްއެމް އެލް-ގްލޫޓާމިން (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ސަޕްލިމެންޓް ކުރެވެއެވެ. ފްލޯ ސައިޓޯމީޓަރ ސްޓޭނިންގ ބަފަރ އެކުލެވިގެންވަނީ 0.22μm ފިލްޓަރޑް ފޮސްފޭޓް ބަފަރޑް ސެލައިން (PBS; Invitrogen) އާއި %3 ހީޓް އިންއެކްޓިވޭޓްޑް އޭބީ ހިއުމަން ސީރަމް (ސިގްމާ) ސަޕްލިމެންޓްކޮށްގެންނެވެ. ސެލް އެންރިޗްމަންޓް ބަފަރ އެކުލެވިގެންވަނީ 0.22μm ފިލްޓަރޑް ޕީބީއެސް އިން ކަމަށާއި، މިއީ %0.5 ހީޓް އިންއެކްޓިވޭޓްޑް ހިއުމަން އޭބީ ސީރަމް (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) އިން ސަޕްލިމެންޓް ކުރެވިފައިވާ ބަފަރެކެވެ.
37 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގެ ފުރިހަމަ މީޑިއަމްގައި ސެލްތައް 10 nM MT DR އަދި 100 μM 2-NBDG އިން 30 މިނެޓް ވަންދެން ސްޓެއިން ކުރިއެވެ. ދެން ސެލްތައް 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން ވައިއޭބިލިޓީ ޑައި eF506 އިން ސްޓެއިން ކުރިއެވެ. އެފްސީ ބްލޮކް (އީބަޔޯސައިންސް) އަދި ބްރިލިއަންޓް ސްޓޭން ބަފަރ (ބީޑީ ބަޔޯސައިންސެސް) ގައި ސެލްތައް އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް، ފްލޯ ސައިޓޯމީޓަރ ސްޓޭނިންގ ބަފަރ ގައި ޑައިލޫޓްކޮށް (އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އިރުޝާދާ އެއްގޮތަށް) ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރާށެވެ. ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ ސްޓޭނިންގ ބަފަރ ގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 20 މިނެޓް ވަންދެން އެންޓިބޮޑީ ސެޓެއް (ތާވަލް S2) އިން ސެލްތައް ސްޓޭން ކުރާށެވެ. ތަޙުލީލު ކުރުމުގެ ކުރިން ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ ސްޓޭނިންގ ބަފަރ (ސައިޓެކް އޮރޯރާ؛ 3L-16V-14B-8R ކޮންފިގްރޭޝަން) ގައި ސެލްތައް އަލުން ސަސްޕެންޑް ކުރުން. ސެލް ކައުންޓް ޑޭޓާ ތަޙުލީލުކުރުމަށް ސްޕެކްޓްރޯފްލޯ އަދި ފްލޯޖޯ ވީ10 ބޭނުންކުރުމާއި، ޑޭޓާ އުފެއްދުމަށް ގްރާފްޕެޑް ޕްރިޒަމް 8 ބޭނުންކުރުން. 2-އެންބީޑީޖީ އަދި އެމްޓީ ޑީއާރުގެ މީޑިއަން ފްލޫރެސެންސް އިންޓެންސިޓީ (އެމްއެފްއައި) ލޮގް ނޯމަލައިޒްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓެއް ސްޓެޓިސްޓިކަލް އެނަލިސިސްއަށް ބޭނުންކޮށްގެން މެޗްޑް ޕޭޝަންޓުން އެކައުންޓް ކުރިއެވެ. 40 އަށް ވުރެ މަދު ހާދިސާތަކެއް ހިނގާ ހުރިހާ އާބާދީތަކެއް ތަހުލީލުން އުނިކުރުން؛ ސްޓެޓިސްޓިކަލް އެނަލިސިސް އަދި ޑޭޓާ ވިޝުއަލައިޒޭޝަން ކުރުމުގެ ކުރިން އެއްވެސް ނެގެޓިވް ވެލިއުއަކަށް 1 ގެ އެމްއެފްއައި ވެލިއުއެއް އެންޓަރކުރުން.
މަތީގައިވާ ޕްރޮސެސް ޕެނަލްގެ މެނުއަލް ގޭޓިންގ ސްޓްރެޓެޖީ ސަޕްލިމެންޓް ކުރުމަށްޓަކައި، ފްލޯޖޯގައި މަރުވެފައިވާ ސެލްތައް ނައްތާލުމަށްފަހު އޮޓޮމެޓިކުން ސެލްތައް ޕޮޕިއުލޭޝަނަށް ޙަވާލުކުރުމަށްޓަކައި، ޝޭޕް ރެސްޓްރިކްޝަން ޓްރީ (FAUST) (21) އިން ފުލް އެނޮޓޭޝަން ބޭނުންކުރިން. އަޅުގަނޑުމެން މެނުއަލްކޮށް އައުޓްޕުޓް މެނޭޖްކުރަނީ މިސްއެލޮކޭޓް ވެފައިވާހެން ހީވާ ޕޮޕިއުލޭޝަންތަކާއި (ޕީޑީ1+ އާއި ޕީޑީ1-ޓިއުމަރ ސެލްތައް އެއްކޮށްލައިގެން) އަދި ރިޓެއިންޑް ޕޮޕިއުލޭޝަންތައް އެއްކޮށްލުމަށެވެ. ކޮންމެ ސާމްޕަލެއްގައި އެވްރެޖްކޮށް %2 އަށްވުރެ ގިނަ ސެލް ހިމެނޭއިރު، ޖުމްލަ 11 ޕޮޕިއުލޭޝަން ހިމެނެއެވެ.
ޕީބީއެމްސީ އާއި ލިއުކޯސައިޓް ވަކިކުރާ ޕްރޮޑަކްޓްސް (STEMCELL Technologies) ވަކިކުރުމަށް ފިކޯލް ގްރޭޑިއަންޓް ޑެންސިޓީ ސެންޓްރިފިގޭޝަން ބޭނުންކުރިއެވެ. ޕީބީއެމްސީން ސީޑީ8 + ޓީ ސެލްތައް ސީޑީ8 މައިކްރޯބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކޮށްގެން އެކަހެރިކޮށް، އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އިރުޝާދާ އެއްގޮތަށް ޓްރާންސްއެކްޓް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކޮށްގެން ފުރިހަމަ މީޑިއަމްގައި 2 ހަފްތާ ވަންދެން ފުޅާކޮށްފައިވެއެވެ. ސެލްތައް IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ހިމެނޭ ފުރިހަމަ މީޑިއަމްގައި 5 ދުވަސް ވަންދެން ބެހެއްޓުމަށްފަހު، ޓްރާންސްއެކްޓް އިން އަލުން ސްޓިމިއުލޭޓް ކުރިއެވެ. 7 ވަނަ ދުވަހު އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އިރުޝާދުގެ މަތިން ޖެހިޖެހިގެން ތިން ބުރެއްގައި ސެލްތައް މުއްސަނދި ކުރުމަށް އިންސާނާގެ ސީޑީ45 މައިކްރޯބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކުރި އެވެ. މި ސެލްތައް ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އެނަލިސިސް އަށް (މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް) އެލިކޯޓް ކުރެވުނުއިރު، އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް އެނަލިސިސް އަށް އެއް މިލިއަން ސެލް ތިން ފަހަރު އެލިކޯޓް ކުރިއެވެ. މި ސާމްޕަލްތައް ޕްރޮސެސްކޮށްފައިވަނީ ތިރީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް އެލްސީ-އެމްއެސް/އެމްއެސް އިންނެވެ. އަޅުގަނޑުމެން ގެއްލިފައިވާ މެޓަބޮލައިޓް ވެލިއު ލަފާކުރީ 1،000 ގެ އަޔަން ނަންބަރަކާއެކުގައެވެ. ކޮންމެ ސާމްޕަލެއް ވެސް ޓޯޓަލް އަޔަން ނަމްބަރު (ޓީއައިސީ) އިން ނޯމަލައިޒްކޮށް، ލޮގަރިޒަމް ގޮތަކަށް ބަދަލުކޮށް، ތަހުލީލު ކުރުމުގެ ކުރިން މެޓަބޯއެނަލިސްޓްއާރ ގައި އޮޓޮމެޓިކުން ނޯމަލައިޒް ކުރެވެއެވެ.
ކޮންމެ ބަލިމީހެއްގެ ސިންގަލް ސެލް ސަސްޕެންޝަން ތެޔޮކޮށް 40 μm ގެ ފިލްޓަރެއް މެދުވެރިކޮށް ފުރިހަމަ މީޑިއަމްއަކަށް (މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް) ފިލްޓަރ ކޮށްފައިވެއެވެ. އުފެއްދުންތެރިޔާގެ ޕްރޮޓޮކޯލްގައިވާ ގޮތުން ސީޑީ8+، ސީޑީ4+ އަދި ސީޑީ45- ސެލްތަކުގެ ސާމްޕަލްތައް މުއްސަނދި ކުރުމަށް މައިކްރޯބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކޮށްގެން މެގްނެޓިކް ބީޑް ސެޕަރޭޝަން އިން ޖެހިޖެހިގެން ތިން ބުރެއްގެ ޕޮޒިޓިވް ސެލެކްޝަން ބޭނުންކުރި އެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ ސެލްތައް ސެލް އެންރިޗްމަންޓް ބަފަރުގައި (މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް) އަލުން ސަސްޕެންޑްކޮށް ގުނާލައެވެ. މި ސެލްތައް ހިއުމަން ސީޑީ8 ބީޑްސް، ހިއުމަން ސީޑީ4 ބީޑްސް ނުވަތަ ހިއުމަން ސީޑީ45 ބީޑްސް (މިލްޓެނީ) އިން 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓްކޮށް، ސެލް އެންރިޗްމަންޓް ބަފަރ އިން ދޮވެފައިވެއެވެ. މި ސާމްޕަލް އެލްއެސް ކޮލަމް (މިލްޓެންޔީ) ތެރެއިން ފޮނުވާލާއިރު، ޕޮޒިޓިވް އަދި ނެގެޓިވް ފްރެކްޝަން އެއްކުރެއެވެ. މުއްދަތު ކުޑަކޮށް، ސެލް ރިކަވަރީ ސްޓެޕް އެންމެ ބޮޑުކުރުމަށްޓަކައި، ދެން ސީޑީ8-ފްރެކްޝަން ބޭނުންކުރަނީ ސީޑީ4+ އެންރިޗްމަންޓްގެ ދެވަނަ ބުރަށް ކަމަށާއި، އޭގެ ފަހުން ސީޑީ45-އެންރިޗްމަންޓަށް ސީޑީ4-ފްރެކްޝަން ބޭނުންކުރެއެވެ. ވަކިކުރުމުގެ މުޅި ޕްރޮސެސްގައި ސޮލިއުޝަން އައިސް މަތީގައި ބަހައްޓާށެވެ.
މެޓަބޮލައިޓް އެނަލިސިސްއަށް ސާމްޕަލްތައް ތައްޔާރުކުރުމަށްޓަކައި އައިސް ފިނި ލޮނު ސޮލިއުޝަނުން އެއްފަހަރު ސެލްތައް ދޮވެ، ކޮންމެ ސާމްޕަލަކަށް %80 މެތަނަލްގެ 1 މިލިލީޓަރު އަޅައި، ވޯރޓެކްސްކޮށް ލިކުއިޑް ނައިޓްރޯޖަންގައި ސްނެޕް ފްރޯޒެން ކުރިއެވެ. މި ސާމްޕަލްތައް ތިން ފްރީޒް-ތޯ ސައިކަލެއްގައި 14،000 އާރުޕީއެމްގައި 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި 15 މިނެޓް ވަންދެން ސެންޓްރިފިއުޖް ކުރިއެވެ. މެޓަބޮލައިޓްތައް ހިމެނޭ ސުޕަރނެޓެންޓް ހިކި ވަންދެން އުފުރާލައެވެ. މި މެޓަބޮލައިޓްތައް އަލުން 50 μl %0.03 ފޯމިކް އެސިޑްގައި ގިރާލުމަށްފަހު، މިކްސް ކުރުމަށް ވޯރޓެކްސްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ސެންޓްރިފިއުޖްކޮށްގެން ކުނި ނައްތާލާފައިވެއެވެ.
މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް މެޓަބޮލައިޓްތައް ނެގުން. މެޓަބޮލޮމިކްސް ރިސާޗަށް ސުޕަރނެޓެންޓް ހައި ޕާފޯމަންސް ލިކުއިޑް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ ފުޅިއަކަށް ބަދަލުކުރުން. ބެޗް އިފެކްޓްސް ހުއްޓުވުމަށްޓަކައި ކޮންމެ ސާމްޕަލަކަށް ވެސް އެއްވަރެއްގެ ސެލްތަކެއް ޓްރީޓް ކުރުމަށް ރެންޑަމް ޓްރީޓްމަންޓް ޕްރޮޓޮކޯލް ބޭނުންކުރުން. އަޅުގަނޑުމެން ކުރިން އޭބީ އެސްސީއައިއެކްސް ކިއުޓްރެޕް 5500 ޓްރިޕްލް ކުއަޑްރޫޕޯލް މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (50) ގައި ޝާއިޢުކޮށްފައިވާ ގްލޯބަލް މެޓަބޮލައިޓްސްގެ ކޮލިޓޭޓިވް އެސެސްމަންޓެއް ކުރިން. ކްރޮމެޓޮގްރަފިކް އެނަލިސިސް އާއި ޕީކް އޭރިއާ އިންޓަގްރޭޝަން ހެދީ މަލްޓިކުއަންޓް ވަރޝަން 2.1 ސޮފްޓްވެއާ (އެޕްލައިޑް ބަޔޯސިސްޓަމްސް އެސްސީއައިއެކްސް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
ގެއްލިފައިވާ މެޓަބޮލައިޓް ވެލިއު ލަފާކުރުމަށް 1000 ގެ އަޔަން ކައުންޓެއް ބޭނުންކޮށްފައިވާއިރު، ސާމްޕަލް ޕްރޮސެސިންގ އިން އިންސްޓްރޫމެންޓަލް އެނަލިސިސް އިން ގެނައި ބަދަލުތައް އިސްލާހުކުރުމަށްޓަކައި ކޮންމެ ސާމްޕަލެއްގެ ޓީއައިސީ ބޭނުންކޮށްގެން ހޯދިފައިވާ ކޮންމެ މެޓަބޮލައިޓްއެއްގެ ނޯމަލައިޒްޑް ޕީކް އޭރިއާ ހޯދިއެވެ. ޓީއައިސީ ނޯމަލައިޒް ކުރުމަށްފަހު ލޮގަރިޒަމް ކޮންވާޝަން އަދި އޮޓޮމެޓިކް ނޯރމް ލައިން ސްކޭލިންގ އަށް މެޓަބޯއެނަލިސްޓްއާރ(51) (ޑިފޯލްޓް ޕެރަމިޓަރ) ބޭނުންކުރެއެވެ. އަޅުގަނޑުމެން ސާމްޕަލް ވައްތަރުތަކުގެ މެދުގައިވާ މެޓަބޮލޯމް ތަފާތުތަކުގެ އެކްސްޕްލޮރޭޓަރީ އެނަލިސިސް ހެދުމަށް ވީގަން އާރ ޕެކޭޖާއެކު ޕީސީއޭ ބޭނުންކުރިއިރު، ބަލިމީހުން ތަޙުލީލުކުރުމަށް ޕާރޝިއަލް ރިޑަންޑަންސީ އެނަލިސިސް ބޭނުންކުރިން. ސާމްޕަލްތަކުގެ މެދުގައިވާ ޔޫކްލިޑިއަން ދުރުމިން ކްލަސްޓަރ ކުރުމަށްޓަކައި ހީޓް މެޕް ޑެންޑްރޯގްރާމް އެއް ހެދުމަށް ވޯޑް މެތޯޑް ބޭނުންކުރުން. އަހަރެމެން މުޅި ސެލް ވައްތަރާއި މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓްގައި ތަފާތު ގޮތަކަށް ގިނަ މެޓަބޮލައިޓްތައް ދެނެގަތުމަށްޓަކައި ސްޓޭންޑަރޑައިޒްޑް މެޓަބޮލައިޓް އެބަންޑަންސް އަށް ލިމާ (52) ބޭނުންކުރިން. ބަޔާންކުރުން ފަސޭހަކުރުމަށްޓަކައި، މޮޑެލް ކަނޑައެޅުމަށްޓަކައި ގްރޫޕް މީން ޕެރަމިޓަރ ބޭނުންކޮށް، މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓްގައި ހުންނަ ސެލް ވައްތަރުތައް ކޮންމެ ގްރޫޕެއްގެ ގޮތުގައި ބަލާ (n = 6 ގްރޫޕް)؛ ސިގްނިފިކޭޝަން ޓެސްޓަށްޓަކައި، އަޅުގަނޑުމެން ކޮންމެ މެޓަބޮލައިޓަކަށް ތިން ތަކުރާރުކޮށް މިންކުރީ ދޮގު ރިޕްލިކޭޝަން އިން ސަލާމަތްވުމަށްޓަކައި، ބަލިމީހާ ލިމާ ޑިޒައިންގައި ހުރަހެއްގެ ގޮތުގައި ހިމަނާފައިވެއެވެ. އެކި ބަލިމީހުންގެ މެޓަބޮލައިޓްތަކުގެ ތަފާތުތައް ބެލުމަށްޓަކައި، ބަލިމީހުން ހިމެނޭ ގޮތަށް ލިމާ މޮޑެލް ވަކި ގޮތަކަށް އެޖެސްޓް ކުރިން. އަޅުގަނޑުމެން ރިޕޯޓް ކުރަނީ ސެލް ވައްތަރާއި މައިކްރޯއެންވަޔަރަންމަންޓާ ދެމެދު ކުރިން ކަނޑައެޅިފައިވާ ތަފާތުގެ މުހިންމުކަން Padj <0.05 (ބެންޖަމިނީ-ހޮޗްބަރގް ކަރެކްޝަން) އެވެ.
މިލްޓެނީ ޑެޑް ސެލް ރިމޫވަލް ކިޓް (>80% ވައިއޭބިލިޓީ) ބޭނުންކޮށްގެން ވައިގަރ އެންރިޗްމަންޓަށްފަހު، 10x 5′ޖީން އެކްސްޕްރެޝަން ޕްރޮޓޮކޯލް ބޭނުންކޮށްގެން ޖުމްލަ ލައިވް ފްރޯޒެން އެސައިޓްސް އަދި ޓިއުމަރ ސާމްޕަލްތަކުގައި ސިންގަލް ސެލް ޓްރާންސްކްރިޕްޓޯމް ސިކުއެންސިންގ ހެދިއެވެ. އެއް ޓިއުމަރ ސާމްޕަލްގެ ވައިއޭބިލިޓީ ދަށްވުމުން އެ ސާމްޕަލް ހިމެނުމަށް ހުރަސްއެޅި ނަމަވެސް، މެޗިން ޓިއުމަރާއި އެސިޓިސް ހުރި ފަސް ކޭސް ތަހުލީލުކޮށްފައިވެއެވެ. ބަލިމީހުންގެ އެތައް ސެލެކްޝަނެއް ހާސިލް ކުރުމަށްޓަކައި، 10x ކްރޯމިއަމް ކޮންޓްރޯލަރުގެ ލޭންތަކުގައި ކޮންމެ ބަލިމީހެއްގެ ސާމްޕަލްތައް އެއްކޮށް، އެސައިޓްސް އާއި ޓިއުމަރ ސައިޓްތައް ވަކިވަކިން ތަޙުލީލު ކުރިން. ސިކުއެންސިންގ އަށް ފަހު [އިލޫމިނާ ހައިސެކް 4000 28×98 ބީޕީ ޕެއަރޑް އެންޑް (ޕީއީ)، ކިއުބެކް ޖީނޯމް؛ އެވްރެޖްކޮށް ޓިއުމަރާއި އެސިޓިސް އަށް ސެލްއަކަށް 73،488 އަދި 41،378 ރީޑްސް]]، އަޅުގަނޑުމެން ބޭނުންކުރީ ސެލްއެސްއެންޕީ އަދި ވިރިއޯ (53) (ސެލްއެސްއެންޕީ އަށް ބިނާކޮށް GRCh38 އިން ފޯރުކޮށްދޭ އާންމު ހިއުމަން އެސްއެންޕީ (ވީސީއެފް) އަށް ޑޯނަރ އައިޑެންޓިޓީއެއް ޙަވާލުކުރެވިފައިވާ ގޮތަށެވެ. ޑަޕްލެކްސްގެ ގޮތުގައި ދެނެގަނެވިފައިވާ ސެލްތަކާއި އެސައިޓްސް އާއި ޓިއުމަރ ސާމްޕަލްތަކުގެ މެދުގައި އެއްގޮތްވާ ސެލްތައް ބާކީކޮށް މި މަސައްކަތުގެ މައްޗަށް ބިނާކޮށް ޑައުންސްޓްރީމް އެނަލިސިސްއަށް ޓިއުމަރާއި އެސައިޓްސްގައި ގިނަ އަދަދަކަށް ސެލް ތަމްސީލުކޮށްފައިވާ ތިން ކޭސް ހިފެހެއްޓިއެވެ (2792 އަދި 4183 ސެލްސް ޓިއުމަރ އަދި އެސައިޓްސް އިން) ތަޙުލީލުކުރުމަށް އަޅުގަނޑުމެން ބޭނުންކުރަނީ އައިގްރާފްގެ (57) ލޫވައިން ކްލަސްޓަރިންގ އޮފް ޝެއަރޑް ނީބަރސް ނެޓްވޯކް (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression ސީޑީ8އޭ އަދި ޖީޒެޑްއެމްއޭ ގެ އެކްސްޕްރެޝަން އިން މާނަކުރެވޭ، ރައިބޯސޯމަލް ޕްރޮޓީން އެކްސްޕްރެޝަން ދަށް ސަބްކްލަސްޓަރސް ނުހިމަނައި އަޅުގަނޑުމެންނަށް އެކްސެސް ކުރެވުނީ އިޒާރ އެޓް އަލް (16) ގެ ޝާއިޢުކުރެވިފައިވާ ޑޭޓާއަށް، އެމީހުންގެ ޓީ-އެސްއެންއީ އެންބެޑިންގ ހިމެނޭ ގޮތަށް، އިމިއުން ސެލް މާކެރސް އާއި އެންއެންއެމްޓީ އެކްސްޕްރެޝަން އާއި ދެމެދު އެކްސްޕްރެޝަން އޮވަރލެޕް ކޮންޓްރޯލް ކުރެވޭނެއެވެ.
ޕީބީއެމްސީ ވަކިކޮށްފައިވަނީ ލޫކޯސައިޓް ސެޕަރޭޝަން ޕްރޮޑަކްޓްސް (ސްޓެމްސެލް ޓެކްނޮލޮޖީސް) އިން ފިކޯލް ގްރޭޑިއަންޓް ޑެންސިޓީ ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށެވެ. ޕީބީއެމްސީ އިން ސީޑީ3 + ސެލްތައް އެކަހެރިކޮށްފައިވަނީ ސީޑީ3 ބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެމްއެންއޭ ހުރި ނުވަތަ ނެތް ހާލަތުގައި ސީޑީ3+ ސެލްތައް އެކްޓިވޭޓް ކޮށްފައިވަނީ ޕްލޭޓް ބައުންޑް ސީޑީ3 (5μg/ml)، ސޮލިއުބަލް ސީޑީ28 (3μg/ml) އަދި އައިއެލް-2 (300 ޔޫ/އެމްއެލް؛ ޕްރޮލިއުކިން) އިންނެވެ. ފުޅާކުރުމުގެ އެންމެ ފަހު ދުވަހު ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ އިން ވައިއޭބިލިޓީ (ފިކްސެބަލް ވައިއޭބިލިޓީ ޑައި eFluor450، eBioscience) އަދި ޕްރޮލިފަރޭޝަން (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ވަޒަންކޮށްފައިވެއެވެ. ޕީއެމްއޭ (20 ng/ml) އަދި އަޔޮނޮމައިސިން (1μg/ml) އިން ސެލްތައް ގޯލްޖީސްޓޮޕް އިން 4 ގަޑިއިރު ސްޓިމިއުލޭޓްކޮށް، CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) އަދި TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) މޮނިޓަރކޮށްގެން އިފެކްޓަރ ފަންކްޝަން އިވެލުއޭޓްކުރުން. ޕީއެމްއޭ (20 ng/ml) އަދި އަޔޮނޮމައިސިން (1μg/ml) އިން 4 ގަޑިއިރު ވަންދެން qPCR އަދި ChIP ސެލްތައް ސްޓިމިއުލޭޓް ކުރާށެވެ. އެލިސާ ސުޕަރނެޓެންޓް އެއްކޮށްފައިވަނީ ޕީއެމްއޭ (20 ng/ml) އަދި އަޔަނޮމައިސިން (1 μg/ml) އިން 4 ގަޑިއިރު ވަންދެން ސްޓިމިއުލޭޓް ކުރުމުގެ ކުރިންނާއި ފަހުންނެވެ.
އާރްނީޒީ ޕްލަސް މިނީ ކިޓް (ކިއައިއޭޖީއެން) ބޭނުންކޮށްގެން އާރްއެންއޭ އައިސޮލޭޓް ކުރުމަށް އުފެއްދުންތެރިޔާގެ ޕްރޮޓޮކޯލް އަށް ތަބާވާށެވެ. ސާމްޕަލް ހޯމޯޖެނައިޒް ކުރުމަށް QIAshredder (QIAGEN) ބޭނުން ކުރާށެވެ. ކޮމްޕްލިމެންޓަރީ ޑީއެންއޭ (ސީޑީއެންއޭ) ސިންތެސައިޒް ކުރުމަށް ހައި ކެޕޭސިޓީ އާރްއެންއޭ ޓު ސީޑީއެންއޭ ކިޓް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކުރުން. ތިރީގައިވާ ޕްރޮބްތަކާއެކު ޖީން އެކްސްޕްރެޝަން (އުފެއްދުންތެރިޔާގެ ޕްރޮޓޮކޯލާ އެއްގޮތަށް) ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ވަޒަންކުރުމަށް ޓެކްމަން ރެޕިޑް އެޑްވާންސްޑް މާސްޓަރ މިކްސް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ބޭނުންކުރުން: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ގްލިސެރަލްޑައިޑް-3-ފޮސްފޭޓް އޮފް ހައިޑްރޯޖަން (GAPDH)] އަދި Hs01010726_m1 (SLC22A2) އެވެ. މި ސާމްޕަލްތައް ހިންގީ މައިކްރޯއެމްޕް އޮޕްޓިކަލް ފިލްމާއެކު މައިކްރޯއެމްޕް ފަސްޓް އޮޕްޓިކަލް 96 ވެލް ރިއެކްޝަން ޕްލޭޓް (އެޕްލައިޑް ބަޔޯސިސްޓަމްސް) ގައި ސްޓެޕްވަންޕްލަސް ރިއަލް ޓައިމް ޕީސީއާރު ސިސްޓަމް (އެޕްލައިޑް ބަޔޯސިސްޓަމްސް) (އެޕްލައިޑް ބަޔޯސިސްޓަމްސް) އިންނެވެ. 35 އަށްވުރެ މަތީގެ އެއްވެސް ސީޓީ ވެލިއުއެއް ޑިޓެކްޝަން ތްރެޝްހޯލްޑަށްވުރެ މަތީގެ އަގެއް ކަމަށް ބެލެވޭއިރު، ޑިޓެކްޓް ނުކުރެވޭ ކަމަށް ފާހަގަކުރެވެއެވެ.
ކުރިން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް ޗިޕް ކުރިއަށް ގެންދިއުން (58). ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ ސެލްތަކަށް ފޯރމަލްޑައިޑް (ފައިނަލް ކޮންސެންޓްރޭޝަން 1.42%) އިން ޓްރީޓްކޮށް ކޮޓަރީގެ ފިނިހޫނުމިނުގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރިއެވެ. ސަޕްލިމެންޓްޑް ސްވެލިންގ ބަފަރ (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl އަދި 0.1% NP-40) އައިސް މަތީގައި 10 މިނެޓް ވަންދެން ބޭނުންކޮށް، ދެން ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް އިމިއުނޯޕްރެސިޕިޓޭޝަން ބަފަރ ގައި އަލުން ސަސްޕެންޑް ކުރާށެވެ (58 ). އެއަށްފަހު ސާމްޕަލް ސޮނިކޭޓް ކޮށްފައިވަނީ ތިރީގައިވާ ސައިކަލްތަކުންނެވެ: 10 ސައިކަލް (20 1 ސިކުންތުގެ ޕަލްސް) އަދި 40 ސިކުންތުގެ ސްޓޭޓިކް ޓައިމް އެވެ. ޗިޕް ގްރޭޑް އިމިއުނޯގްލޮބިއުލިން ޖީ (ސެލް ސިގްނަލިންގ ޓެކްނޮލޮޖީ؛ 1μl)، ހިސްޓޯން އެޗް3 (ސެލް ސިގްނަލިންގ ޓެކްނޮލޮޖީ؛ 3μl)، އެންއެފްއޭޓީ (އިންވިޓްރޯޖެން؛ 3μl) އަދި އެސްޕީ1 (ސެލް ސިގްނަލިންގ ޓެކްނޮލޮޖީ؛ 3μl) އެންޓިބޮޑީސް ސާމްޕަލް އާއި އެކު 4°CC ޝޭކްގައި އެއްރޭ ވަންދެން އިންކިއުބޭޓް ކުރުން. ޕްރޮޓީން އޭ ބީޑްސް (ތަރމޯ ފިޝަރ ސައިންޓިފިކް) ސާމްޕަލްއާއެކު 4 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި މަޑުމަޑުން ތެޅިގަނެގެން 1 ގަޑިއިރު ބެހެއްޓުމަށްފަހު، ޑީއެންއޭ މުއްސަނދި ކުރުމަށް ޗެލެކްސް ބީޑްސް (ބަޔޯ-ރެޑް) ބޭނުންކޮށް، ޕްރޮޓީން ހަޖަމުކުރުމަށް ޕްރޮޓީނޭޒް ކޭ (ތަރމޯ ފިޝަރ) ބޭނުންކުރުން. ޓީއެންއެފްα ޕްރޮމޯޓަރ ހޯދިފައިވަނީ ޕީސީއާރު އިން: ކުރިއަށް، ޖީޖީޖީ ޓީއޭޓީ ސީސީޓީ ޓީޖީއޭ ޓީޖީސީ ޓީޓީޖީ ޓީޖީޓީ؛ އެއާ ޚިލާފަށް ޖީޓީޖީ ސީސީއޭ އޭސީއޭ އެކްޓް ޖީސީސީ ޓީޓީޓީ އޭޓީއޭ ޓީޖީ (207-ބީޕީ ޕްރޮޑަކްޓް) އެވެ. މި ތަސްވީރުތައް ތައްޔާރުކޮށްފައިވަނީ އިމޭޖް ލެބް (ބަޔޯ-ރެޑް) އިން ކަމަށާއި، މި ތަސްވީރުތައް ކިތަންމެ ވަރަކަށް ވެސް ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ އިމޭޖްޖޭ ސޮފްޓްވެއާ ބޭނުންކޮށްގެން ކަމަށެވެ.
ސެލް ކަލްޗަރ ސުޕަރނެޓެންޓް އެއްކޮށްފައިވަނީ މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށެވެ. މި ކަނޑައެޅުން ކުރިއަށް ގެންގޮސްފައިވަނީ އިންސާނީ ޓީއެންއެފްα އެލިސާ ކިޓް (އިންވިޓްރޯޖެން)، ހިއުމަން އައިއެލް-2 އެލިސާ ކިޓް (އިންވިޓްރޯޖެން) އަދި ހިއުމަން އައިއެފްއެން-γ އެލިސާ ކިޓް (އެބްކެމް) ގެ އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އުސޫލުތަކާ އެއްގޮތަށެވެ. އުފެއްދުންތެރިޔާގެ ޕްރޮޓޮކޯލްގައިވާ ގޮތުން ސުޕަރނެޓެންޓް ޑައިލޫޓް ކޮށްފައިވަނީ ޓީއެންއެފްα އާއި އައިއެލް-2 ހޯދުމަށް 1:100 ގައި، އަދި އައިއެފްއެން-γ ހޯދުމަށް 1:3 އިންނެވެ. 450 ނޯޓް މީޓަރުގައި އެބްޒޯރބަންސް ވަޒަންކުރުމަށް އެންވިޝަން 2104 މަލްޓިލޭބަލް ރީޑަރ (ޕަރކިންއެލްމަރ) ބޭނުންކުރުން.
ޕީބީއެމްސީ ވަކިކޮށްފައިވަނީ ލޫކޯސައިޓް ސެޕަރޭޝަން ޕްރޮޑަކްޓްސް (ސްޓެމްސެލް ޓެކްނޮލޮޖީސް) އިން ފިކޯލް ގްރޭޑިއަންޓް ޑެންސިޓީ ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށެވެ. ޕީބީއެމްސީ އިން ސީޑީ3 + ސެލްތައް އެކަހެރިކޮށްފައިވަނީ ސީޑީ3 ބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ. އެމްއެންއޭ ހުރުމުން ނުވަތަ ނެތް ހާލަތުގައި ސީޑީ3+ ސެލްތައް ޕްލޭޓް ބައުންޑް ސީޑީ3 (5μg/ml)، ސޮލިއުބަލް ސީޑީ28 (3μg/ml) އަދި އައިއެލް-2 (300 ޔޫ/އެމްއެލް؛ ޕްރޮލިއުކިން) އިން 3 ދުވަސް ވަންދެން އެކްޓިވޭޓް ކުރިއެވެ. 3 ދުވަސް ފަހުން ސެލްތައް އެއްކޮށް %0.9 ސެލައިން އިން ދޮވެ، ޕެލެޓް ސްނެޕް ފްރޯޒެން ކުރިއެވެ. ސެލް ކައުންޓް ހެދީ 123ކައުންޓް އީބީޑްސް ބޭނުންކޮށްގެން ފްލޯ ސައިޓޮމެޓްރީ (ސައިޓެކް އޮރޯރާ؛ 3L-16V-14B-8R ކޮންފިގްރޭޝަން) އިންނެވެ.
މަތީގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް މެޓަބޮލައިޓްތައް ނެގުން. ހިކިފައިވާ އެކްސްޓްރެކްޓް ރިކޮންސްޓިޓިއުޓް ކޮށްފައިވަނީ 4000 ސެލް އިކުއިވެންޓްސް/μl ގެ ކޮންސެންޓްރޭޝަންގައެވެ. ރިވަރސްޑް-ފޭސް ކްރޮމެޓޮގްރަފީ (1290 އިންފިނިޓީ II، އެޖިލެންޓް ޓެކްނޮލޮޖީސް، ސަންޓާ ކްލާރާ، ސީއޭ) އަދި ކޯރޓެކްސް ޓީ3 ކޮލަމް (2.1×150 އެމްއެމް، ޕާރޓިކަލް ސައިޒް 1.6-μm، ޕޯރ ސައިޒް 120-Å؛ #186008500، ވޯޓަރސް) އިން ސާމްޕަލް ތަޙުލީލުކުރުން. ޕޯލާ މާސް ސްޕެކްޓްރޯމީޓަރ (6470، އެޖިލެންޓް)، މިއީ އިލެކްޓްރޯސްޕްރޭ އަޔަނައިޒޭޝަން ޕޮޒިޓިވް މޯޑުގައި އޮޕަރޭޓް ކުރާ މީހެކެވެ. މޮބައިލް ފޭސް އޭ އަކީ %0.1 ފޯމިކް އެސިޑް (އެޗް2އޯ ގައި)، މޮބައިލް ފޭސް ބީ އަކީ %90 އެސިޓޮނިޓްރައިލް، %0.1 ފޯމިކް އެސިޑް އެވެ. އެލްސީ ގްރޭޑިއަންޓަކީ %100 އޭ އަށް 0 އާއި 2 މިނެޓާއި %99 ބީ އަށް 2 އާއި 7.1 މިނިޓާއި %99 ބީ އަށް 7.1 އާއި 8 މިނިޓާއި ދެމެދުގެ މުއްދަތެއް ކަމަށާއި ދެން މޮބައިލް ފޭސް އޭ އާއި އެކު ކޮލަމް އަލުން އިކުއިލިބްރޭޓް ކުރާނީ 0.6 މިލިލީޓަރު/މިނިޓްގެ ފްލޯ ރޭޓެއްގައި 3 މިނެޓް ވަންދެން ކަމަށެވެ. . ފްލޯ ރޭޓަކީ 0.4ml/min އަށް ވާއިރު، ކޮލަމް ޗެމްބަރު 50 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސް އަށް ހޫނުކުރެއެވެ. ރިޓެންޝަން ޓައިމް (RT) އަދި ޓްރާންސްފޯމަޝަން (RT = 0.882 މިނެޓް، ޓްރާންސްފޯމަޝަން 1 = 137→94.1، ޓްރާންސްފޯމަޝަން 2 = 137→92 , ކޮންވާޝަން 3 = 137→78) ޤާއިމުކުރުމަށް އެމްއެންއޭގެ ޕިއުރ ކެމިކަލް ސްޓޭންޑަރޑް (M320995، ޓޮރޮންޓޯ ރިސާރޗް ކެމިކަލް ކޮމްޕެނީ، ނޯތު ޔޯކް، އޮންޓޭރިއޯ، ކެނެޑާ) ބޭނުންކުރުން. މި ތިން ޓްރާންސިޝަން ވެސް ރަނގަޅު ރިޓެންޝަން ޓައިމްގައި ދިމާވުމުން، ސްޕެސިފިކްޓީ ޔަގީން ކުރުމަށްޓަކައި ޓްރާންސިޝަން 1 ބޭނުންކުރަނީ ކުއަންޓިފިކޭޝަނަށެވެ. އެމްއެންއޭ (ޓޮރޮންޓޯ ރިސާޗް ކެމިކަލް ކޮމްޕެނީ) ގެ ސްޓޭންޑަރޑް ކަރވް އުފެއްދީ ސްޓޮކް ސޮލިއުޝަން (1 މިލިގްރާމް/އެމްއެލް) ގެ ހަ ސީރިއަލް ޑައިލޫޝަން އިން 0.1، 1.0، 10 އަދި 100 އެންޖީ/އެމްއެލް އަދި 1.0 އަދި 10μg/ml ލިކުއިޑްގެ ސްޓޭންޑަރޑް ހޯދިއެވެ. ޑިޓެކްޝަން ލިމިޓަކީ 1 ng/ml ކަމަށާއި، ލައިނަރ ރިސްޕޮންސް އަކީ 10 ng/ml އާއި 10μg/ml އާއި ދެމެދުގެ މިންވަރެއް ކަމަށް ވެސް ޑރ. ދެ މައިކްރޯލީޓަރުގެ ސާމްޕަލް އަދި ސްޓޭންޑަރޑްގެ ކޮންމެ އިންޖެކްޝަނެއް އެލްސީ/އެމްއެސް އެނަލިސިސްއަށް ބޭނުންކުރާއިރު، އެނަލިސިސް ޕްލެޓްފޯމްގެ ސްޓެބިލިޓީ ޔަގީންކުރުމަށްޓަކައި ކޮންމެ އަށް އިންޖެކްޝަނަކުން މިކްސްޑް ކޮލިޓީ ކޮންޓްރޯލް ސާމްޕަލްއެއް ހިންގައެވެ. އެމްއެންއޭ އިން ފަރުވާ ދިން ހުރިހާ ސެލް ސާމްޕަލްތަކެއްގެ އެމްއެންއޭ ރިސްޕޮންސްތައް ހުރީ އެސޭގެ ލައިނަރ ރޭންޖްގެ ތެރޭގައެވެ. ޑޭޓާ އެނަލިސިސް ހެދީ މާސްހަންޓަރ ކުއަންޓިޓޭޓިވް އެނަލިސިސް ސޮފްޓްވެއަރ (v9.0، އެޖިލެންޓް) ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ.
ދެވަނަ ޖީލުގެ αFR-CAR ކޮންސްޓްރަކްޓް ނަގާފައިވަނީ ސޮންގް އެޓް އަލް އިންނެވެ. (59) އެވެ. ކުރުކޮށް ބުނާނަމަ މި ކޮންސްޓްރަކްޓްގައި ހިމެނެނީ ތިރީގައިވާ ކޮންޓެންޓްތަކެވެ: ސީޑީ8އޭ ލީޑަރ ސިކުއެންސް، ހިއުމަން αއެފްއާރު-ސްޕެސިފިކް ސިންގަލް ޗޭން ވެރިއޭބަލް ފްރެގްމެންޓް، ސީޑީ8އޭ ހިންޖް އަދި ޓްރާންސްމެމްބަރޭން ރީޖަން، ސީޑީ27 އިންޓްރާސެލިއުލަރ ޑޮމެއިން އަދި ސީޑީ3ޒް އިންޓްރާސެލިއުލަރ ޑޮމެއިން. ފުރިހަމަ ސީއޭއާރު ސިކުއެންސް ޖެންސްކްރިޕްޓް އިން ސިންތެސިސްކޮށް، އޭގެ ފަހުން ޓްރާންސްޑަކްޝަން އެފިޝަންސީ ވަޒަންކުރުމަށް ބޭނުންކުރާ ޖީއެފްޕީ އެކްސްޕްރެޝަން ކެސެޓްގެ އަޕްސްޓްރީމްގައި ދެވަނަ ޖީލުގެ ލެންޓިވައިރަލް އެކްސްޕްރެޝަން ވެކްޓަރ އަށް ކްލޯން ކުރިއެވެ.
ލެންޓިވައިރަސް އުފެދެނީ HEK293T ސެލްތައް ޓްރާންސްފެކްޝަން ކުރުމުން [އެމެރިކަން ޓައިޕް ކަލްޗަރ ކަލެކްޝަން (ATCC); ޑަލްބެކޯގެ މޮޑިފައިޑް އީގަލް މީޑިއަމްގައި %10 ފީޓަލް ބޮވައިން ސީރަމް (އެފްބީއެސް) އަދި %1 ޕެންސްޓްރެޕް ހިމެނޭ ގޮތަށް ހެދިފައިވާ، އަދި ބޭނުންކޮށްފައިވާ ސީއޭއާރް-ޖީއެފްޕީ ވެކްޓަރ އަދި ޕެކޭޖިންގ ޕްލާސްމިޑްސް (psPAX2 އަދި pMD2.G، Addgene) ގައި ބޭނުންކުރަނީ ލިޕޯފެކްޝަން އެމިން (ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) އެވެ. ވައިރަސް ހިމެނޭ ސުޕަރނެޓެންޓް ޓްރާންސްފެކްޓް ކުރުމަށްފަހު 48 އަދި 72 ގަޑިއިރު ފަހުން އެއްކޮށް ފިލްޓަރކޮށް އަލްޓްރާސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށް ކޮންސެންޓްރޭޓް ކުރިއެވެ. ކޮންސެންޓްރޭޓެޑް ވައިރަލް ސުޕަރނެޓެންޓް ޓްރާންސްޑަކްޝަން ވަންދެން -80 ޑިގްރީ ސެލްސިއަސްގައި ރައްކާކުރާށެވެ.
ޕީބީއެމްސީ ވަކިކުރަނީ ހެލްތީ ޑޯނަރ ލިޔުކޯސައިޓް ސެޕަރޭޝަން ޕްރޮޑަކްޓްސް (ސްޓެމްސެލް ޓެކްނޮލޮޖީސް) އިން ފިކޯލް ގްރޭޑިއަންޓް ޑެންސިޓީ ސެންޓްރިފިގޭޝަން މެދުވެރިކޮށެވެ. ޕީބީއެމްސީ އިން ސީޑީ8+ ސެލްތައް އެކަހެރިކުރުމަށް ޕޮޒިޓިވް ސެލެކްޝަން ސީޑީ8 މައިކްރޯބީޑްސް (މިލްޓެނީ) ބޭނުންކުރުން. ޓްރާންސްއެކްޓް (މިލްޓެނީ) އާއި ޓެކްސްމެކްސް މީޑިއަމް [މިލްޓެނީ؛ %3 ހީޓް އިންއެކްޓިވޭޓްޑް ހިއުމަން ސީރަމް، %1 ޕެންސްޓްރެޕް އަދި އައިއެލް-2 (300 ޔޫ/އެމްއެލް) އިން ސަޕްލިމެންޓް ކުރެވިފައިވެއެވެ]. ސްޓިމިއުލޭޝަން އަށް ފަހު 24 ގަޑިއިރު ފަހުން ޓީ ސެލްތައް ލެންޓިވައިރަސް (106 ސެލް އަށް 10 μl ކޮންސެންޓްރޭޓެޑް ވައިރަސް ސުޕަރނެޓެންޓް) އިން ޓްރާންސްޑޫސް ކުރިއެވެ. ސައިޓެކް އޮރޯރާ (އެފްއެސްސީ (ފޯވާޑް ސްކެޓަރ)/އެސްއެސްސީ (ސައިޑް ސްކެޓަރ) ގައި، ސިންގަލް، ޖީއެފްޕީ+ ގައި ޓްރާންސްޑަކްޝަން އަށް ފަހު 1 ދުވަހުން 3 ދުވަސް ފަހުން، މަދުވެގެން %30 ގެ ޓްރާންސްޑަކްޝަން އެފިޝަންސީ ދައްކާލުމަށް ސެލްތަކުގެ ޖީއެފްޕީ އެކްސްޕްރެޝަން ވަޒަންކުރުން .
CAR-T ސެލްތައް އިމިއުނޯކަލްޓް (STEMCELL Technologies; supplemented with 1% PenStrep) ގައި 24 ގަޑިއިރު ވަންދެން ކަލްޗަރ ކޮށްފައިވަނީ ތިރީގައިވާ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން: ފަރުވާ ނުދީ، 250 μM އެޑިނޯސިން ނުވަތަ 10 mM MNA އިން ފަރުވާ ދިނުމުންނެވެ. ޕްރީޓްރީޓްމަންޓަށްފަހު ސީއޭއާރް-ޓީ ސެލްތައް ޕީބީއެސް އިން ދޮވެ، 20،000 އެސްކޭ-އޯވީ-3 ސެލް އާއި ގުޅުވައިގެން [ATCC; in McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS and 1% PenStrep at 10: ސަޕްލިމެންޓް ކޮށްފައިވާ އިމިއުނޯކަލްޓް މީޑިއަމްގައި 1 ގެ އިފެކްޓަރ ޓު ޓާގެޓް ރޭޝިއޯ ޓްރިޕްލިކޭޓް އިން އެމްޕްލިފައިޑް ކުރެވުނެވެ. ނެގެޓިވް އަދި ޕޮޒިޓިވް ކޮންޓްރޯލްގެ ގޮތުގައި ބޭނުންކޮށްފައިވަނީ ޑިޖިޓަލިސް ސެޕޮނިން (0.5mg/ml؛ ސިގްމާ-އަލްޑްރިޗް) އިން ލައިޒްކޮށްފައިވާ އެސްކޭ-އޯވީ-3 ސެލްތަކާއި އެސްކޭ-އޯވީ-3 ސެލްތަކެވެ. 24 ގަޑިއިރު ކޯ ކަލްޓިވޭޝަން އަށް ފަހު ސުޕަރނެޓެންޓް އެއްކޮށް ލެކްޓޭޓް ޑީހައިޑްރޯޖެނެޒް (އެލްޑީއެޗް) މިންކުރީ އުފެއްދުންތެރިޔާގެ އިރުޝާދުގެ މަތިން (އެލްޑީއެޗް ގްލޯ ސައިޓޮޓޮކްސިސިޓީ އެސޭ ކިޓް، ޕްރޮމެގާ) އެވެ. އެލްޑީއެޗް ސުޕަރނެޓެންޓް އެލްޑީއެޗް ބަފަރުގައި 1:50 އަށް ޑައިލޫޓް ކުރިއެވެ. މަރާލުމުގެ އިންސައްތަ ވަޒަންކޮށްފައިވަނީ ތިރީގައިވާ ފޯމިއުލާ ބޭނުންކޮށްގެންނެވެ: މަރާލުމުގެ އިންސައްތަ = ކަރެކްޝަންގެ އިންސައްތަ / މެކްސިމަމް ކިލިންގ ރޭޓް x 100%، މިތަނުގައި ކަރެކްޝަންގެ އިންސައްތަ = ހަމައެކަނި ކޯ-ކަލްޗަރ-ޓީ ސެލްސް، އަދި މެކްސިމަމް ކިލިންގ ރޭޓް = ޕޮޒިޓިވް ކޮންޓްރޯލް-ނެގެޓިވް ކޮންޓްރޯލް.
ލިޔުމުގައި ނުވަތަ ތަކެތި އަދި އުސޫލުތަކުގައި ބަޔާންކޮށްފައިވާ ގޮތަށް ތަފާސްހިސާބު ތަޙުލީލުކުރުމަށް ގްރާފްޕެޑް ޕްރިޒަމް 8، މައިކްރޮސޮފްޓް އެކްސެލް ނުވަތަ އާރ v3.6.0 ބޭނުންކުރުން. އެއް ބަލިމީހަކުން (އެސިޓިސް އަދި ޓިއުމަރ ފަދަ) އެތައް ސާމްޕަލްއެއް ނަގާނަމަ، އަޅުގަނޑުމެން ޕެއަރޑް ޓީ ޓެސްޓެއް ބޭނުންކުރަން ނުވަތަ އެކަށީގެންވާ ގޮތެއްގައި ލައިނަރ ނުވަތަ ޖެނެރަލައިޒްޑް މޮޑެލްއެއްގައި ރެންޑަމް އިފެކްޓެއްގެ ގޮތުގައި ބަލިމީހާ ހިމަނަމެވެ. މެޓަބޮލޮމިކްސް އެނަލިސިސް އަށް މުހިންމުކަން ޓެސްޓް ހެދެނީ ތިން ފަހަރު ބަހައްޓައިގެންނެވެ.
މި ލިޔުމަށް ބޭނުންވާ ސަޕްލިމެންޓަރީ މެޓީރިއަލްސް http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 އަށް ބައްލަވާށެވެ
މިއީ ކްރިއޭޓިވް ކޮމަންސް އެޓްރިބިއުޝަން-ނޮން-ކޮމާޝަލް ލައިސަންސްގެ ޝަރުތުތަކުގެ ދަށުން ބެހިފައިވާ އޮޕަން އެކްސެސް އާޓިކަލެކެވެ. ރިފަރަންސް.
ނޯޓް: އަޅުގަނޑުމެން ހަމައެކަނި އެދެނީ އީމެއިލް އެޑްރެސް ފޯރުކޮށްދިނުމަކީ ޕޭޖަށް ރެކޮމެންޑް ކުރާ މީހާއަށް އެނގޭނެ ގޮތަށް، އީމެއިލް ފެންނަން ބޭނުންވާ ކަމާއި އެއީ ސްޕޭމް ނޫންކަން އެނގޭނެ ގޮތަކަށެވެ. އަޅުގަނޑުމެން އެއްވެސް އީމެއިލް އެޑްރެހެއް ކެޕްޗަރ ނުކުރާނަން.
މި ސުވާލަކީ ޒިޔާރަތްކުރާ މީހެއްތޯ ޓެސްޓްކޮށް، އޮޓޮމެޓިކުން ސްޕޭމް ހުށަހެޅުން ހުއްޓުވުމަށް ބޭނުންކުރާ ސުވާލެކެވެ.
މާރިސާ ކޭ ކިލްގޯރ (މާރިސާ ކޭ ކިލްގޯރ)، ސާރާ މެކްފަރސަން (ސާރާ މެކްފަރސަން)، ލޯރެން ޖީ ޒަކަރިއަސް (ލޯރެން ޖީ ޒަކަރިއަސް)، އަބީޖެއިލް އެލީ އަރިސް ޖީ ވޮޓްސަން (އެޗް ވޮޓްސަން)، ޖޯން ސްޓޭގް (ޖޯން ސްޓޭގް)، ބްރެޑް އެޗް ނެލްސަން (ބްރޭޑް އެޗް ނެލްސަން)، ރާލްފް ޖޭ ޑި ބެލާޑިނީ (ރާލްފް ޖޭ ޑިބެރަޑިނިސް)، ރަސެލް ޖީ ޖޯންސް (ރަސެލް) އެވެ ޖީ ޖޯންސް)، ފިނިއަސް ޓީ ހެމިލްޓަން (ފިނިއަސް ޓީ.
އެމްއެންއޭ އަކީ ޓީ ސެލްތަކުގެ ދިފާއީ ނިޒާމު ދަމަހައްޓައިދިނުމުގައި އެހީތެރިވެދޭ އެއްޗެއް ކަމަށާއި، މިއީ އިންސާނާގެ ކެންސަރަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ކުރެވިދާނެ އިމިއުނޯތެރަޕީ ޓާގެޓެއް ތަމްސީލުކުރާ އެއްޗެކެވެ.
މާރިސާ ކޭ ކިލްގޯރ (މާރިސާ ކޭ ކިލްގޯރ)، ސާރާ މެކްފަރސަން (ސާރާ މެކްފަރސަން)، ލޯރެން ޖީ ޒަކަރިއަސް (ލޯރެން ޖީ ޒަކަރިއަސް)، އަބީޖެއިލް އެލީ އަރިސް ޖީ ވޮޓްސަން (އެޗް ވޮޓްސަން)، ޖޯން ސްޓޭގް (ޖޯން ސްޓޭގް)، ބްރެޑް އެޗް ނެލްސަން (ބްރޭޑް އެޗް ނެލްސަން)، ރާލްފް ޖޭ ޑި ބެލާޑިނީ (ރާލްފް ޖޭ ޑިބެރަޑިނިސް)، ރަސެލް ޖީ ޖޯންސް (ރަސެލް) އެވެ ޖީ ޖޯންސް)، ފިނިއަސް ޓީ ހެމިލްޓަން (ފިނިއަސް ޓީ.
އެމްއެންއޭ އަކީ ޓީ ސެލްތަކުގެ ދިފާއީ ނިޒާމު ދަމަހައްޓައިދިނުމުގައި އެހީތެރިވެދޭ އެއްޗެއް ކަމަށާއި، މިއީ އިންސާނާގެ ކެންސަރަށް ފަރުވާ ދިނުމަށް ކުރެވިދާނެ އިމިއުނޯތެރަޕީ ޓާގެޓެއް ތަމްސީލުކުރާ އެއްޗެކެވެ.
©2021 އެމެރިކަން އެސޯސިއޭޝަން ފޯރ ދަ އެޑްވާންސްމަންޓް އޮފް ސައިންސް. ހުރިހާ ހައްޤުތަކެއް ލިބިގެންވެއެވެ. އޭއޭއޭއެސް އަކީ ހިނާރީ، އަގޯރާ، އޮއާރޭ، ކޯރަސް، ކްލޮކްސްއެސް، ކްރޮސްރެފް އަދި ކައުންޓަރުގެ ޕާޓްނަރެކެވެ. ސައިންސްއެޑްވާންސެސް އައިއެސްއެސްއެން 2375-2548.